MUC1在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中的表達改變和初步機制研究.pdf

1、【研究背景】：
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是世界范圍內高發(fā)病率和高死亡率的慢性疾病之一，它以漸進性不完全可逆的慢性氣流受限為特征，并與吸煙或吸入有害顆?；驓怏w引起的異常炎癥反應有關。大量研究證明，氣道慢性炎癥是COPD發(fā)病的核心內容，其形成機制十分復雜，涉及多種炎性細胞，在肺的不同部位有肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞的增加，激活的炎癥細胞釋放各

2、種炎性介質如TNF-α，IL-8，從而損傷肺組織，促進COPD的發(fā)生和發(fā)展。
　　粘蛋白MUC1（人類用MUC1表示，動物用Muc1表示）是一種I型跨膜糖蛋白，分為細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)，主要分布在呼吸道、胃腸道、生殖道上皮細胞以及免疫相關細胞表面。它對正常上皮起潤滑和保護作用，同時它的胞內區(qū)還可以介導信號轉導和細胞粘附功能。近期研究表明不論是銅綠假單胞菌感染還是呼吸道合胞體病毒感染引起的急性炎癥中，都可以觀察到 Muc1的表達

3、量在感染后大量增加，而且這種表達增加與TNF-α、中性粒細胞彈性蛋白酶等的表達密切相關。從而提示 Muc1是在感染和炎癥發(fā)生時起作用的重要內源性分子。
　　但在出現(xiàn)肺部慢性炎癥的COPD患者中，肺中MUC1的表達水平如何，其表達水平是否也與炎癥因子水平相關，目前尚不清楚。
　　【研究目的】：
　　本實驗研究了不同來源標本，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者氣道粘膜和不同時期的痰液標本，香煙煙霧誘導的COPD模型小鼠和

4、細菌脂多糖誘導的急性炎癥動物肺組織和支氣管肺泡灌洗液，以及利用香煙煙霧提取物和細菌脂多糖直接刺激的A549細胞中MUC1的表達改變情況。并分別檢測了COPD患者不同時期痰液中 IL-8和TNF-α水平及COPD小鼠和急性炎癥小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α的水平。旨在揭示長期煙霧刺激和急性細菌脂多糖刺激后小鼠肺內Muc1的表達變化與TNF-α變化相關性，進而探討COPD患者中MUC1的表達變化及其可能的機制，為COPD的發(fā)病機制提供新的

5、理論基礎，并為COPD的預防和治療提供新的作用靶點。
　　【研究方法】：
　　本研究采用臨床病人標本、動物實驗和細胞培養(yǎng)相結合的方法。（1）通過纖支鏡活檢留取COPD患者的氣道粘膜，采用免疫組化染色的方法來觀察MUC1的表達水平。分別收集COPD病人急性期和緩解期的痰液標本，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測痰液上清中MUC1的量表達，同時檢測痰液中TNF-α和IL-8的水平。（2）利用單純熏煙6個月建立COPD小鼠模型，

6、采用Western blot印跡法和ELISA檢測COPD模型小鼠肺內Muc1表達水平，并檢測支氣管肺泡灌洗液中TNF-α的含量及細胞分類計數(shù)。（3）采用脂多糖滴鼻致敏C57小鼠后建立急性炎癥動物模型，分別收集12h、24h、48h、96h、1w后的肺組織和支氣管肺泡灌洗液，并分別采用Western blot和ELISA的方法檢測各時間段的肺內Muc1的表達水平；同時檢測小鼠肺泡灌洗液中TNF-α的水平；（4）采用細胞培養(yǎng)的方法，分別用

7、香煙煙霧提取物和脂多糖刺激A549細胞24h后，收集細胞蛋白，采用Western blot的方法檢測MUC1的表達水平。
　　【實驗結果】：
　　一、COPD患者氣道粘膜上皮MUC1的表達增加
　　1、在COPD患者的氣道粘膜上皮MUC1免疫組化表達陽性且較正常氣道粘膜的表達量增多。
　　2、COPD患者急性期痰液上清中MUC1胞內片段表達較緩解期明顯升高，且痰液上清 IL-8水平、TNF-α水平均較緩解期升高，

8、差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；急性期痰液中白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)及中性細胞比值均較緩解期明顯升高（P<0.05）；經(jīng)簡單相關分析可知：急性期和緩解期的IL-8均與中性粒細胞比值成正相關（急性期，r=0.463，p=0.046；緩解期，r=0.547，p=0.015）；急性期和緩解期的中性粒細胞數(shù)與TNF-α的含量呈正相關（急性期r=0.489，P=0.040；緩解期r=0.794，P=0.000）。通過多元逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，痰

9、液MUC1水平受痰白細胞總數(shù)、FVC和年齡的影響。
　　二、熏煙動物模型實驗結果
　　1、用單純熏煙成功建立了COPD小鼠模型，其肺功能檢測顯示：氣道阻力顯著增加，肺順應性、吸氣峰流速和呼氣峰流速顯著下降，結果較正常組小鼠相比，差異具有統(tǒng)計學意義；且光鏡下觀察COPD小鼠肺組織的病理改變可見：支氣管粘膜和肺實質中均有大量炎癥細胞浸潤，肺組織肺泡結構大小不一，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合，肺泡腔擴大，呈現(xiàn)出典型的肺氣腫病理改變。

10、
　　2、COPD小鼠肺組織及BALF中Muc1表達量明顯高于對照組正常小鼠，其差異具有統(tǒng)計學意義。COPD小鼠肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)及巨噬細胞數(shù)均較對照組增加，TNF-α含量也較對照組明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　三、急性炎癥動物模型實驗結果
　　1、運用脂多糖滴鼻成功建立急性炎癥小鼠模型，光鏡下觀察模型組小鼠肺組織病理切片可見：肺間質明顯水腫，肺實質和支氣管粘膜中可見大量炎性細胞

11、浸潤。
　　2、經(jīng)western blot檢測小鼠肺組織Muc1胞內片段水平，脂多糖處理12h后小鼠肺Muc1胞內片段水平明顯升高，且具有統(tǒng)計學意義；24h后已下降至與對照組無統(tǒng)計學差異，脂多糖處理48h、96h和1w后的小鼠肺中已檢測不到Muc1胞內片段變化（與對照組相比）。BALF中Muc1胞內片段的表達量在各時間段一直處于較低水平，與對照組相比，無明顯變化。然而，BALF中Muc1的胞外片段水平在12h時最高，24h開始下降

12、，1周后下降至正常水平。脂多糖處理12h，24h，48h，96h，1w后的小鼠肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比均明顯升高，較對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。并且，各時間段的肺泡灌洗液中TNF-α的含量均較對照組升高。
　　四、細胞實驗結果分別用香煙煙霧提取物和脂多糖直接刺激A549細胞，24小時后收集細胞蛋白，均發(fā)現(xiàn)其中MUC1的表達量升高。
　　【實驗結論】：
　　1、COPD患者氣道粘膜上皮M