雞精液稀釋液設(shè)計(jì)與篩選方法學(xué)研究.pdf

1、迄今為止，國(guó)內(nèi)外雖有不少有關(guān)雞精液稀釋液研究的相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于精液稀釋液設(shè)計(jì)與篩選方法學(xué)的研究尚屬缺乏。在這一領(lǐng)域沒(méi)有一套完整而實(shí)用的理論體系，對(duì)諸如精液稀釋液pH、滲透壓、緩沖能力和配方物質(zhì)組成進(jìn)行調(diào)控、篩選和評(píng)價(jià)，如緩沖能力就沒(méi)有具體參數(shù)可供借鑒，也缺乏測(cè)定方法等。有鑒于此，本論文擬從方法學(xué)的角度，探索雞精液稀釋液設(shè)計(jì)與篩選方面的指標(biāo)體系和測(cè)定方法，用以指導(dǎo)制備高受精率的雞精液稀釋液，以適應(yīng)現(xiàn)代養(yǎng)雞生產(chǎn)的需要。 本論文包括三

2、個(gè)部分，第一部分是雞精液稀釋液設(shè)計(jì)與主要液體質(zhì)量指標(biāo)的確定、控制與測(cè)定研究。對(duì)精液稀釋液pH、滲透壓和緩沖能力梯度進(jìn)行理論控制，然后以實(shí)際測(cè)定結(jié)果檢驗(yàn)控制的準(zhǔn)確性。第二部分是雞精液稀釋液實(shí)驗(yàn)室篩選研究——稀釋精液體外精子生存質(zhì)量與形態(tài)學(xué)觀察研究。通過(guò)研究不同pH、滲透壓、緩沖能力和溶質(zhì)種類(lèi)的稀釋液以及保存時(shí)間和溫度對(duì)保存于其中的精子形態(tài)和機(jī)能的影響，確定最佳稀釋液的合理參數(shù)。第三部分是雞稀釋精液人工授精應(yīng)用研究，以稀釋精液進(jìn)行人工授精，

3、以受精率對(duì)稀釋液及其設(shè)計(jì)和篩選方法的優(yōu)劣做出客觀的評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①pH的理論控制準(zhǔn)確率在98.69﹪，滲透壓準(zhǔn)確率在95.9﹪-99.1﹪，緩沖指數(shù)準(zhǔn)確率在97.6﹪以上。 ②在2℃-5℃低溫條件下，稀釋液緩沖指數(shù)不影響精子活率，但影響精子畸形率。緩沖指數(shù)348時(shí)，精子畸形率極顯著地低于緩沖指數(shù)119.6～228.8和461.6～1147.6范圍的畸形率。為了保持精子正常的形態(tài)，不但要求要有合適的pH和滲透壓，同

4、時(shí)還要求有適中的緩沖指數(shù)。稀釋液緩沖指數(shù)對(duì)精子畸形率的影響較精子活率的影響大。 ③檸檬酸鈉、葡萄糖對(duì)雞精液的保存，具有重要作用，而氯化鉀在雞精液稀釋液中并不是必需的；復(fù)方稀釋液保存效果普遍優(yōu)于單方稀釋液；低溫下雞精液稀釋液滲透壓應(yīng)為等滲或接近等滲，且最適滲透壓還與構(gòu)成稀釋液的物質(zhì)種類(lèi)和相互配比有關(guān)系；稀釋液PH應(yīng)接近中性，最好與精液pH保持一致；在緩沖指數(shù)為3.894-7.257的范圍內(nèi)，緩沖指數(shù)與精子保存效果的兩個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)顯

5、著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。 ④精子最高生存指數(shù)出現(xiàn)在三種有機(jī)鹽的稀釋液中；兩種無(wú)機(jī)鹽液中精子存活時(shí)間最長(zhǎng)，但精子畸形率很高；滲透壓值與精子頭部畸形類(lèi)型高度相關(guān)(p＜0.01)，與精子頭部彎曲且膨脹百分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)為-0.93，與精子頭部單純彎曲百分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)為0.94。在300mmol/L時(shí)，精子生存指數(shù)、存活時(shí)間均較好；500mmol/L時(shí)精子畸形率最低；滲透壓對(duì)保存效果有極顯著的影響，物質(zhì)種類(lèi)對(duì)保存48h精子形態(tài)有顯著地影響，且滲透

6、壓與精子畸形類(lèi)型有一定關(guān)系。 ⑤無(wú)機(jī)鹽氯化鈉、氯化鉀在350mmol/L滲透壓濃度單獨(dú)使用時(shí)可以獲得較高的精子存活時(shí)間和精子生存指數(shù)，但不利于維持雞精子細(xì)胞膜的完整性。有機(jī)鹽檸檬酸鈉、檸檬酸鉀在350mmol/L滲透壓濃度時(shí)精子存活時(shí)間和生存指數(shù)比400mmol/L滲透壓濃度時(shí)要低，可知最佳的滲透壓濃度在350mmol/L-400mmol/L之間。谷氨酸鈉在250mmol/L滲透壓濃度時(shí)，精子存活時(shí)間、精子生存指數(shù)和精子形態(tài)完整

7、率均較好，其最佳滲透壓不是等滲，而是偏低滲。在本實(shí)驗(yàn)條件下這三中有機(jī)鹽液對(duì)雞精子形態(tài)有穩(wěn)定和保護(hù)作用。葡萄糖、蔗糖、果糖單成分液均有穩(wěn)定或保護(hù)雞精子形態(tài)完整的良好作用；葡萄糖的最適滲透壓濃度接近250mmol/L，蔗糖的在200mmol/L-250mmol/L之間。氯化鈉和氯化鉀以5∶1比例制成350mmol/L滲透壓濃度時(shí)可以獲得比單獨(dú)使用時(shí)更高的精子存活時(shí)間和生存指數(shù)，但不能改變無(wú)機(jī)鹽對(duì)雞精子細(xì)胞膜的破壞作用。250mmol/L谷氨

8、酸鈉和450mmol/L的果糖以1∶2組合后可以獲得較為理想的雞精子機(jī)能和形態(tài)保存效果。 ⑥由果糖、谷氨酸鈉、檸檬酸鉀和硫酸鎂四種物質(zhì)組成的7液最好，其pH為6.7，滲透壓為360mmol/L，緩沖指數(shù)為382，精子存活時(shí)間264h，活率大于0.6的存活時(shí)間148h，生存指數(shù)133。另外3液、4液、8液和9液保存效果亦較好，表明在pH6.7-7.2，滲透壓278mmol/L-434mol/L，緩沖指數(shù)280-582的范圍內(nèi)，對(duì)精

9、子的生存較為適宜。這一結(jié)果與在37℃下保存試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。 ⑦通過(guò)37℃下對(duì)雞精液進(jìn)行稀釋保存效果的觀察，發(fā)現(xiàn)保存效果最好的是6-3和6-4液，其精子存活時(shí)間分別為9.9±1.55h，9.4±1.56h，生存指數(shù)分別為3.76±1.22，3.50±1.31，與其它幾個(gè)稀釋相比，差異極顯著(p＜0.01)。從而證明：適宜精子37℃下存活的pH范圍是6.7～7.75，滲透壓為335mmol/L-395mmol/L，緩沖指數(shù)為35

10、0。同時(shí)，結(jié)果表明，只有稀釋液的pH，滲透壓和緩沖指數(shù)均合適時(shí)，保存效果才會(huì)好。 ⑧雞精子在滲透壓為738、703mmol/L的1＃、2＃液中不能生存；在390、290和145mmol/L的6＃、7＃、8＃液中，存活時(shí)間依次為9.8±1.66h、9.1±1.43h、8.9±1.45h，生存指數(shù)依次為3.7±1.14、3.3±1.28、3.2±1.32極顯著地長(zhǎng)或高于3＃、4＃液的2.4±0.78h、3.2±0.81h和0.12±

11、0.07、0.58±0.11(P＜0.01)，顯著地長(zhǎng)或高于5＃液的6.5±1.21h和1.3±0.42(P＜0.05)。表明適于精子生存的滲透壓以等滲為宜，但同時(shí)受配方物質(zhì)成分的影響。 ⑨稀釋液溶劑是影響稀釋保存效果的重要因素，以注射用水制備的3液精子存活時(shí)間和生存指數(shù)分別為134.5h、48.58，顯著地優(yōu)于以蒸餾水制備的稀釋液。在葡萄糖-磷酸鹽稀釋液中，添加谷氨酸鈉比添加檸檬酸鈉保存效果好，精子存活時(shí)間和生存指數(shù)分別提高2

12、2﹪、33.5﹪。另外，在3℃保存雞精液時(shí)，稀釋液等滲條件比添加能源物質(zhì)如葡萄糖更重要。 ⑩通過(guò)對(duì)4個(gè)精液稀釋液的pH、滲透壓、緩沖指數(shù)、3℃-5℃下精子存活時(shí)間與生存指數(shù)的測(cè)定，并在生產(chǎn)條件下用這4個(gè)稀釋液進(jìn)行人工授精試驗(yàn)表明：雞精液稀釋液pH、滲透壓、緩沖指數(shù)是影響精子存活時(shí)間、生存指數(shù)和受精率的重要因子。pH為7.0，滲透壓為330mmol/L，緩沖指數(shù)為461的1號(hào)液，精子存活時(shí)間為254±33h，生存指數(shù)為95±22，

13、受精率為96.4﹪，極顯著地高于原精對(duì)照組和另外3個(gè)稀釋液。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論：通過(guò)本文建立的計(jì)算和實(shí)測(cè)方法預(yù)先對(duì)精液稀釋液的pH、滲透壓和緩沖能力三項(xiàng)液體指標(biāo)進(jìn)行控制，能夠準(zhǔn)確地設(shè)定待配精液稀釋液的物理指標(biāo)，為精液稀釋液的實(shí)驗(yàn)室篩選奠定良好基礎(chǔ)；采用精子機(jī)能指標(biāo)(精子總存活時(shí)間、精子生存指數(shù))和精子形態(tài)學(xué)指標(biāo)(精子形態(tài)完整率或精子畸形率)相結(jié)合的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，在實(shí)驗(yàn)室低溫(1℃-5℃)和高溫(37℃)下進(jìn)行稀釋