三種紫色土硝化作用及其硝化微生物的研究.pdf

1、硝化作用是土壤中重要的生物化學(xué)過(guò)程，包括氨氧化過(guò)程和亞硝化過(guò)程，其中氨氧化過(guò)程是限速步驟。因此，對(duì)硝化作用的研究主要集中在氨氧化過(guò)程。氨氧化過(guò)程是微生物主導(dǎo)的生物過(guò)程，最早研究指出氨氧化過(guò)程由氨氧化細(xì)菌完成，氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)打破了僅由氨氧化細(xì)菌完成硝化作用的傳統(tǒng)的觀念，氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)對(duì)于完善全球氮循環(huán)有重要的作用。研究不同生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌，至今也還不能明確其在生態(tài)系統(tǒng)中究竟是功能冗余還是競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致生態(tài)位分異，也不能明確影

2、響氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌在氨氧化過(guò)程中相對(duì)貢獻(xiàn)率的環(huán)境因子。不同生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌豐度、群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)貢獻(xiàn)率的研究，對(duì)于氨氧化過(guò)程有重要意義。其中影響氨氧化作用的環(huán)境因子有多種，如：土壤類型、溫度、水分、氧氣含量和pH、銨態(tài)氮含量等。其中pH和銨態(tài)氮的含量是兩個(gè)最關(guān)鍵的因子。
　　紫色土是土壤學(xué)科中具有特殊地位的土壤之一，主要分布在中國(guó)的亞熱帶地區(qū)，以四川盆地為主，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有十分重要的地位。按照 pH和碳酸

3、鹽含量分為酸性、中性和石灰性紫色土。土壤 pH是影響土壤硝化作用的因素之一，不僅會(huì)對(duì)土壤硝化作用的進(jìn)程產(chǎn)生影響，而且還會(huì)對(duì)硝化微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。
　　本實(shí)驗(yàn)選取采自重慶永川的酸性紫色土(pH=5.3)和中性紫色土(pH=7.2)以及四川鹽亭的石灰性紫色土(pH=8.5)，采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每種土樣共設(shè)有三種處理，包括13CO2標(biāo)記處理、12CO2對(duì)照處理和C2H2+13CO2對(duì)照處理。土壤樣品在2

4、8℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56天，每周加入100mg/kgN以及相應(yīng)體積的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)培養(yǎng)0天和培養(yǎng)56天的樣品進(jìn)行分析測(cè)定，測(cè)定pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定AOA和AOB amoA功能基因的豐度；克隆文庫(kù)方法測(cè)定AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)；Miseq測(cè)序方法測(cè)定總的微生物。結(jié)果如下：
　　經(jīng)過(guò)56天的培養(yǎng)，三種紫色土C2H2+13CO2處理硝態(tài)氮含量與培養(yǎng)初期相比均沒有變化，說(shuō)明三種紫色土氨氧化作用都是化能自養(yǎng)

5、微生物完成；中性紫色土12CO2和13CO2處理硝態(tài)氮含量分別為536.2、472.9mg/kg，與培養(yǎng)初期12.7mg/kg相比，明顯升高，發(fā)生了強(qiáng)烈的硝化作用，酸性紫色土12CO2和13CO2處理硝態(tài)氮含量分別為5.2和4.5mg/kg，與培養(yǎng)初期6.1mg/kg相比，沒有明顯變化；石灰性紫色土12CO2和13CO2處理硝態(tài)氮含量分別為5.3和4.0mg/kg，與培養(yǎng)初期0.6mg/kg相比，有略微的增加，與中性紫色土相比，變化幅度

6、較小，硝化作用幾乎沒有進(jìn)行。
　　三種紫色土經(jīng)過(guò)56天的培養(yǎng)，各處理氨氧化古菌的數(shù)量均有不同程度的減小，中性紫色土各處理氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的拷貝數(shù)均遠(yuǎn)大于酸性紫色土和石灰性紫色土各處理，說(shuō)明氨氧化微生物適宜在中性環(huán)境下生長(zhǎng)。
　　從NO3--N和NH4+-N含量的變化只能知道中性紫色土有硝化作用發(fā)生，從氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的豐度變化可以說(shuō)明部分氨氧化微生物在起作用，仍需要進(jìn)一步檢驗(yàn)是哪種氨氧化微生物發(fā)揮作用。對(duì)中性紫色

7、土13CO2標(biāo)記處理和12CO2對(duì)照處理總DNA進(jìn)行Cscl超高速密度梯度離心，將離心液體分為15層，進(jìn)行純化，通過(guò)普通PCR擴(kuò)增，結(jié)合凝膠電泳，得出初步結(jié)論，再對(duì)每層進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)中性紫色土AOA和AOB同時(shí)被標(biāo)記，但是標(biāo)記程度不深，在中性紫色土中AOA和AOB共同驅(qū)動(dòng)氨氧化過(guò)程。采用克隆文庫(kù)的方法對(duì)中性紫色土各處理樣品構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，培養(yǎng)初期與56天13CO2培養(yǎng)處理AOA發(fā)揮活性的均屬于Group1.1b，AOB均屬

8、于Nitrosospira cluster3。
　　采用Miseq測(cè)序?qū)θN紫色土微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，用shannon值表示測(cè)序序列物種的多樣性，中性紫色土shannon值>石灰性紫色土shannon值>酸性紫色土shannon，說(shuō)明中性紫色土各處理土壤樣品菌群多樣性>石灰性紫色土各處理土壤樣品菌群多樣性>酸性紫色土各處理土壤樣品菌群多樣性。稀釋曲線說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，在0.97相似性水平下，三種紫色土各處理土壤樣品稀釋曲

9、線均趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合格。各處理土壤樣品中都檢測(cè)到了Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Actinobacteria(放線菌)、Bacteroidetes(擬桿菌)和Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)，在中性紫色土中檢測(cè)到Nitrospirae（硝化螺旋菌門），其中變形菌門在三種紫色土中都大約占有20％

10、的比例。三種紫色土在加入尿素經(jīng)過(guò)56天培養(yǎng)后微生物種類的變化以及比例變化情況不同，酸性紫色土和石灰性紫色土在加入尿素經(jīng)過(guò)56天培養(yǎng)后13C標(biāo)記處理和乙炔抑制處理變化幅度相同，而中性紫色土13C標(biāo)記處理和乙炔抑制處理變化幅度不同，13C標(biāo)記處理變化幅度大于乙炔抑制處理。三種紫色土各處理中氨氧化微生物均屬于Nitrospira(硝化螺菌屬)和Nitrosospira(亞硝化螺菌屬)。通過(guò)對(duì)中性紫色土13CO2標(biāo)記處理和12CO2對(duì)照處理總D

11、NA分層樣品進(jìn)行Miseq測(cè)序，挑選出其中的硝化微生物序列，發(fā)現(xiàn)AOB和NOB占總測(cè)序數(shù)的最大比例均出現(xiàn)在重層，對(duì)氨氧化微生物的標(biāo)記程度進(jìn)行驗(yàn)證，和定量PCR的結(jié)果相同。
　　本研究闡述了三種 pH紫色土硝化作用和氨氧化微生物的差異，探明中性紫色土氨氧化作用的主要推動(dòng)者。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出以下結(jié)論：(1)三種pH紫色土氨氧化微生物的豐度不同，氨氧化微生物適宜在中性環(huán)境下生長(zhǎng)。(2)中性紫色土中氨氧化過(guò)程由氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌共同推動(dòng)