Slo3通道對(duì)小鼠精子Ca2+信號(hào)作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:不育不孕癥是影響人類繁衍和心理健康的一種重要臨床疾病，其中約有一半的病因在于男性。精子是男性生育最重要的因素之一，由睪丸生成，它逐漸成熟后貯存在附睪內(nèi)，但此時(shí)的精子是不具有授精能力。精子進(jìn)入雌性生殖道后，隨著理化環(huán)境（pH值、滲透壓和化學(xué)成份等）的改變，會(huì)經(jīng)歷獲能、超活化和頂體反應(yīng)等生理過(guò)程，最終完成授精。這些生理過(guò)程是精子功能必不可少的部分，對(duì)精子完成授精至關(guān)重要。
　　與在其它細(xì)胞相似，Ca2+作為精子細(xì)胞的第

2、二信使扮演著重要的角色，其直接或者間接調(diào)控精子獲能、超活化和頂體反應(yīng)等重要生理過(guò)程。Ca2+通過(guò)精子細(xì)胞膜上的Ca2+通道流入細(xì)胞中。目前利用電生理技術(shù)在小鼠精子上檢測(cè)到電流只有兩種，一是由CatSper通道介導(dǎo)的Ca2+電流;另一是由Slo3通道介導(dǎo)的K+電流。已經(jīng)有研究表明小鼠精子上最主要的K+離子通道——Slo3在精子的獲能過(guò)程中具有重要作用。隨著精子胞內(nèi)堿化，精子膜上的pH依賴的Slo3通道隨之開(kāi)放，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位超極化。膜電位

3、超極化可能通過(guò)兩方面影響精子Ca2+信號(hào):一方面增加Ca2+內(nèi)流的驅(qū)動(dòng)力使Ca2+內(nèi)流增多;另一方面降低電壓依賴的CatSper通道開(kāi)放概率而減少Ca2+內(nèi)流。盡管推斷Slo3通道是精子Ca2+信號(hào)的重要調(diào)節(jié),但其單獨(dú)對(duì)的Ca2+信號(hào)作用尚不明確。在諸多的Slo1通道特異的以及廣泛的K+通道阻斷劑中，如CTX、 IbTX、TEA、4-AP以及奎尼丁等，只有奎尼丁能強(qiáng)效抑制Slo3通道。
　　另外活性氧物質(zhì)(Reactive oxy

4、gen species，ROS)對(duì)小鼠精子功能也具有影響作用。雖然適量的ROS與精子正常生理功能密切相關(guān)，但是ROS過(guò)量時(shí)會(huì)引起細(xì)胞氧化-抗氧化失衡，對(duì)精子造成嚴(yán)重的損傷，降低精子活性、抑制頂體反應(yīng)、嚴(yán)重影響精子的授精能力。ROS對(duì)精子造成的損傷與Slo3-/-精子的表型非常相似，另外已知ROS對(duì)Slo1通道有抑制作用，而Slo3與Slo1在結(jié)構(gòu)上非常相似，基于這些相似性我們推斷ROS可能通過(guò)作用于Slo3通道而對(duì)精子胞內(nèi)Ca2+信號(hào)有

5、影響作用。通過(guò)本課題的研究希望探索到男性不育與Slo3通道的相關(guān)病因，以及為開(kāi)發(fā)新型、安全、有效的男性避孕藥提供理論依據(jù)。
　　方法:一、利用熒光共聚焦Ca2+成像技術(shù)，對(duì)三個(gè)月以上的雄鼠精子處理后進(jìn)行實(shí)驗(yàn);對(duì)細(xì)胞進(jìn)行以下處理:空白對(duì)照組（Ctrl）、奎尼丁處理組（Ctrl+Qui）、過(guò)氧化氫(H2O2)處理組，隨機(jī)選取三個(gè)月以上的雄性小鼠。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:1、取小鼠附睪尾部分裝在離心管中離心;2、將離心后的精子分置在已經(jīng)涂有Cell-

6、Tak和Poly-L-lysine hydrobromide等試劑的容器中，并使細(xì)胞充分貼壁;3、在精子充分貼壁的容器中加入Fluo-4 AM染料，在保證室溫、避光等實(shí)驗(yàn)條件下使細(xì)胞染色30分鐘;4、將黏貼有精子的容器充分清洗后，在60倍油鏡下觀察精子給藥后的熒光變化，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，接收波長(zhǎng)535-565 nm。
　　二、利用膜片鉗技術(shù):在全細(xì)胞模式下充分研究奎尼丁對(duì)KSper的抑制，預(yù)期找到奎尼丁阻斷精子本身K+電流的

7、劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)果:1、奎尼丁會(huì)使精子細(xì)胞Ca2+信號(hào)降低，并且這種降低作用與奎尼丁濃度呈正相關(guān)，即隨著奎尼丁濃度的增加，其對(duì)精子Ca2+信號(hào)的抑制作用也增加。奎尼丁實(shí)驗(yàn)濃度分別為0.1μM、1μM、10μM、100μM和1000μM，加藥后觀察到精子細(xì)胞Ca2+信號(hào)都下降，0.1μM濃度的奎尼丁可以引起精子內(nèi)Ca2+信號(hào)降低約16％;1μM濃度的奎尼丁可以引起精子內(nèi)Ca2+信號(hào)發(fā)生大約28％的下降;10μM濃度的奎尼丁就

8、可以引起精子內(nèi)Ca2+信號(hào)發(fā)生更大的變化，大約降低45％;而100μM及1000μM濃度的奎尼丁引起精子細(xì)胞Ca2+信號(hào)降低的幅度更大，分別約73％和90％。信號(hào)下降一般的藥物濃度(IC50)大約是11μM。有趣的是奎尼丁抑制KSper的IC50大約是10μM。
　　2、我們初步的數(shù)據(jù)表明H2O2也影響精子Ca2+信號(hào)。但與奎尼丁不同的是，過(guò)氧化氫在低濃度時(shí)表現(xiàn)出對(duì)精子Ca2+信號(hào)的促進(jìn)作用;在高濃度時(shí)則表現(xiàn)出較大的抑制作用。過(guò)氧