高磷對大鼠血管平滑肌細胞膠原表達影響的研究.pdf

1、目的:本研究通過β-甘油磷酸體外處理大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)，觀察其對血管平滑肌細胞細胞膠原表達的誘導(dǎo)，進一步探討高磷對大鼠血管平滑肌鈣化的影響。以高磷為切入點，觀察大鼠血管平滑肌細胞分化過程的動態(tài)變化特點并探討其相關(guān)的分子機制，用不同的實驗方法研究高磷刺激下血管平滑肌細胞各膠原的不同表達，從而為慢性腎臟病患者中心血管疾病高發(fā)病率原因的研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，幫助臨床防治尿毒癥心血管事件的發(fā)生及新藥的開發(fā)。
　　 方法:<

2、br>　　 1.選擇SD雄性大鼠，無菌條件下取胸主動脈，原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞。
　　 2.細胞鑒定
　　 2.1 雙目倒置相差顯微鏡直接觀察細胞形態(tài)
　　 2.2 用SABC法對傳代的細胞進行A-平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學(xué)染色。
　　 3.高磷刺激對平滑肌細胞增殖的影響觀察以不同濃度的β-甘油磷酸（10mmol/Lβ-甘油磷酸、15mmol/Lβ-甘油磷酸、20mmol/Lβ-甘油磷酸）處理平滑肌細胞

3、，MTT法測定細胞增殖，與空白對照組比較，觀察高磷刺激對平滑肌細胞增殖的影響。
　　 4.高磷刺激對平滑肌細胞膠原表達的影響以β-甘油磷酸(10mmol/L)處理平滑肌細胞，分別留取0、3、6、9天的細胞提取RNA，RT-PCR檢測Ⅰ，Ⅱ，Ⅹ型膠原mRNA的表達情況，并與空白對照組進行比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.血管平滑肌細胞培養(yǎng)
　　 1.1 血管平滑肌細胞培養(yǎng)結(jié)果
　　 1.1.1 細胞鑒

4、定:雙目倒置相差顯微鏡下，VSMCs為梭形細胞，呈典型的谷-峰狀生長。
　　 1.1.2 用SABC法對傳代的細胞進行A-平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學(xué)染色在高倍鏡下可以見到胞核用蘇木素復(fù)染后呈淡藍色，卵圓形居中，胞質(zhì)內(nèi)有大量棕色與細胞長軸平行的平滑肌肌動蛋白絲。
　　 1.2 不同濃度高磷刺激平滑肌細胞觀察其增殖結(jié)果(MTT結(jié)果)MTT法檢測血管平滑肌細胞增殖結(jié)果顯示，10mmol/Lβ-甘油磷酸組細胞增殖情況（0.304

5、±0.005）和15mmol/Lβ-甘油磷酸組細胞增殖情況（0.264±0.005）明顯高于空白對照組（0.203±0.010）(P＜0.05)，20mmol/Lβ-甘油磷酸組細胞增殖情況（0.202±0.101）與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);10mmol/Lβ-甘油磷酸組細胞增殖情況與15mmol/Lβ-甘油磷酸組細胞增殖情況相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 1.3 高磷刺激血管平滑肌細胞Ⅰ型膠原的表達

6、結(jié)果PCR電泳高磷組Ⅰ型膠原表達3d（0.932±0.114）、6d(0.715±0.009)、9d（0.652±0.051）高于空白對照組（0.351±0.089），4組之間比較差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);6d（0.715±0.009）低于3d（0.932±0.114），兩組之間比較差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);9d（0.652±0.051）明顯低于3d（0.932±0.114），兩組之間比較差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P

7、＜0.05)。結(jié)果顯示:Ⅰ型膠原基因表達在第三天升高并達到高峰，第六天、第九天與第三天相比有所下降，但都高于空白對照組。
　　 1.4 高磷刺激血管平滑肌細胞Ⅱ型膠原的表達結(jié)果PCR電泳顯示高磷組Ⅱ型膠原蛋白基因表達3d（1.071±0.102）低于空白對照組（1.812±0.066）(P＜0.05)，6d（2.035±0.087）高于空白對照組（1.812±0.066）(P＜0.05)，6d（2.035±0.087）明顯高于3

8、d（1.071±0.102）(P＜0.05)。結(jié)果顯示:高磷刺激血管平滑肌細胞Ⅱ型膠原表達第六天升高。
　　 1.5 高磷刺激血管平滑肌細胞Ⅹ型膠原的表達結(jié)果PCR電泳顯示高磷刺激血管平滑肌細胞Ⅹ型膠原表達3d（0.802±0.066）高于空白對照組Ⅹ型膠原表達（0.677±0.035），2組之間比較差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);9d（0.521±0.045）明顯高于空白對照組(0.677±0.035)，2組之間比較差異

9、有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);6d（0.627±0.091）與空白對照組（0.677±0.035）比較，2組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);3d(0.802±0.066)明顯高于9d（0.521±0.045），兩組之間比較差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示:高磷刺激血管平滑肌細胞Ⅹ型膠原表達于第三天升高并達到高峰，隨著時間的推移，其膠原表達有所下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗采用組織塊貼壁法成