NDRG1基因啟動(dòng)子甲基化在前列腺癌中的初步研究.pdf

1、目的:
　　前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家是前列腺癌的高發(fā)區(qū)，而我國(guó)發(fā)病率明顯低于上述地區(qū)。近年來(lái)隨著環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變等，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著廣大男性的健康。
　　腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種因素通過(guò)不同途徑激活原癌基因和（或）使抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和凋亡失去理性控制。DNA甲基化是目前表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，特別是CpG島甲基化異常所致的抑癌基因

2、失活及癌基因激活。最近研究證明，前列腺癌中基因表型的改變，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，特別是抑癌基因DNA的甲基化致表達(dá)異常，成為研究重點(diǎn)。NDRG1基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌候選基因，NDRG1蛋白有去磷酸化作用，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白分子酪氨酸的磷酸化水平，抑制細(xì)胞的增殖、分化和活性等。
　　雖然NDRG1基因?qū)δ[瘤的抑制功能已得到證實(shí)，但在前列腺癌中的作用機(jī)制仍不十分清楚，其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制等也尚未完全明確。本研究通過(guò)檢測(cè)前列腺

3、癌細(xì)胞系、人正常前列腺細(xì)胞、前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中NDRG1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，并對(duì)前列腺癌細(xì)胞系進(jìn)行去甲基化干預(yù)后，觀察腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況及NDRG1基因mRNA的表達(dá)情況。探討NDRG1基因啟動(dòng)子甲基化在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為前列腺癌的診斷和治療提供新的依據(jù)和方向。
　　方法:
　　1.運(yùn)用生物信息學(xué)及相關(guān)軟件，獲取NDRG1基因的5'上游序列，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域和CpG島位置，參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物

4、。
　　2.應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(bisulfite-sequeneing PCR，BSP)檢測(cè)4種前列腺癌細(xì)胞系(PC3、LNCaP、DU145和22RV1)和1種人正常前列腺細(xì)胞系RWPE-1、10例前列腺癌組織和10例良性前列腺增生組織中NDRG1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)并比較篩選出甲基化程度最高的細(xì)胞系。
　　3.運(yùn)用不同濃度（5，10，15，20μmol/L）甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5-Aza-CdR)分別作用

5、前列腺癌細(xì)胞(DU145)24，48，72小時(shí)，用RT-PCR法測(cè)定用藥前后DU145細(xì)胞中NDRG1基因mRNA表達(dá)水平的變化。
　　4.運(yùn)用BSP法檢測(cè)用5-氮雜胞苷處理前后DU145中NDRG1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的差異，MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，NDRG1啟動(dòng)子區(qū)域位于-3720bp～7079bp，長(zhǎng)度為3360bp; NDRG1基因啟動(dòng)子序列存在四個(gè)CpG島

6、，位于577bp～24455bp，1868bp。
　　2.根據(jù)BSP結(jié)果計(jì)算NDRG1啟動(dòng)子甲基化率，4種前列腺癌細(xì)胞系的甲基化率分別為24.8％(PC3)、36.2％(22RV1)、48.6％(LNCaP)、69.5％(DU145)，1種人正常前列腺細(xì)胞系的甲基化率4.8％(RWPE-1)，10例前列腺癌組織的甲基化率為(48.6±5.3)％，10例良性前列腺增生組織的甲基化率為(4.3±2.1)％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0

7、.05)。
　　3.前列腺癌細(xì)胞DU145經(jīng)10mol/L的5-Aza-CdR處理后，NDRG1基因啟動(dòng)子的甲基化率由干預(yù)前的69.5％下降至11.4％，而NDRG1基因mRNA表達(dá)明顯增高，隨劑量的增加表達(dá)增強(qiáng)。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-氮雜胞苷能明顯抑制前列腺癌細(xì)胞DU145的增殖，并在一定范圍與藥物濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　NDRG1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島在前列腺癌細(xì)胞和組織中呈高甲基