小續(xù)命湯有效成分組對缺血性腦卒中恢復早期的神經(jīng)保護作用研究.pdf

1、腦卒中(stroke)，又稱腦血管意外，是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，其臨床表現(xiàn)主要以猝然昏厥、口眼歪斜、半身不遂、舌強言蹇和智力障礙為特征。流行病學研究顯示，缺血性腦卒中的發(fā)病率占所有腦卒中的60～80％，并且以每年8.7％的速率增長，而出血性腦卒中的發(fā)病率以每年1.7％的速率降低。隨著我國老齡化人口的增多，缺血性腦卒中發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。然而，由于缺血性腦卒中發(fā)病的病理進程復雜，迄今為止，正式被批準使用的安全有效的治療

2、藥物還為數(shù)不多。許多研究證實，線粒體通過多種機制在缺血性腦卒中病理生理進程中扮演著重要的角色，是缺血性損傷的重要亞細胞靶標。中藥復方小續(xù)命湯是中醫(yī)從外風論治療缺血性腦卒中的經(jīng)典有效方劑。小續(xù)命湯有效成分組包含中藥復方小續(xù)命湯中所有與其治療腦缺血損傷密切相關的藥理活性組分。因此，采用大腦中動脈暫時閉塞所致腦缺血再灌注大鼠為觀察對象，從整體水平上考察中藥復方小續(xù)命湯有效成分組對缺血性腦卒中的保護作用，探討線粒體在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中的作用

3、。
　　第一部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期的總體保護作用研究
　　目的:考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期的總體保護作用。
　　方法:選用健康雄性SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實現(xiàn)再灌注。應用Zea-Longa's級標準評分法評價動物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和陽性藥銀杏葉提

4、取物EGb761組，以假手術大鼠作為對照組，術后1～14天灌胃給藥，每日一次。通過Zea-Longa's級標準評分、改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)和轉(zhuǎn)角實驗(CT)等系列行為學評價手段來評測小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠不同恢復時期行為學的變化，每天一次，連續(xù)測定14天。選用TTC染色法觀察大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹。
　　結(jié)果:與模型組相比，隨著給藥時間延長，小續(xù)命湯有效成分組能夠降低MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評

5、分，表現(xiàn)為大鼠前后肢屈曲程度降低，行走趨于正常，在平衡木上停留時間增長，感覺功能恢復靈敏，轉(zhuǎn)角實驗中MCAO大鼠向右轉(zhuǎn)向的比率接近正常;其中自MCAO術后5天起，小續(xù)命湯有效成分組能明顯改善MCAO大鼠上述神經(jīng)行為學表現(xiàn)，與模型組相比差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)。同時小續(xù)命湯有效成分組能夠明顯減少術后5天和14天缺血再灌注大鼠腦組織梗死體積百分比(P＜0.01），縮小術后5天缺血再灌注大鼠的半球腫脹(P＜0.01）。

6、r>　　結(jié)論:小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠損傷恢復早期即產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。
　　第二部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期腦組織氧化還原水平失衡的影響
　　目的:考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期腦組織氧化還原水平失衡的影響。
　　方法:選用健康雄性SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實現(xiàn)再灌注。應用Zea-Longa's級

7、標準評分法評價動物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和陽性藥銀杏葉提取物EGb761組，以假手術大鼠作為對照組，術后1～5天灌胃給藥，每日一次。提取分離給藥5天后MCAO大鼠缺血半暗帶和核心區(qū)腦組織，通過測定腦組織內(nèi)蛋白質(zhì)羰基含量、丙二醛(MDA)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性，來評估小續(xù)命湯有效成分組對缺血再灌注大鼠腦組織氧化應激損傷的改善作用。通過測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶

8、(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等內(nèi)源性抗氧化酶的活力和還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)等內(nèi)源性抗氧化劑的含量變化，來研究小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的保護作用。
　　結(jié)果:與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥5天后，能夠顯著降低MCAO大鼠腦組織中一氧化氮合酶(NOS)活性(P＜0.05)，明顯降低丙二醛(MDA)和蛋白羰基含量(P＜0.05

9、，P＜0.01)，緩解缺血再灌注后大鼠腦組織氧化應激損傷;與此同時，小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著提高大鼠腦組織過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及谷胱甘肽還原酶(GR)的活性(P＜0.05，P＜0.01)，但對還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量影響不明顯。
　　結(jié)論:小續(xù)命湯有效成分組能夠調(diào)節(jié)局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期腦組織氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，從而對大鼠腦神經(jīng)元細胞的起到保護作

10、用。
　　第三部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期腦線粒體功能損傷的影響
　　目的:考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠恢復早期腦線粒體功能損傷的影響。
　　方法:選用健康雄性SD大鼠，采用插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實現(xiàn)再灌注。應用Zea-Longa's級標準評分法評價動物腦缺血程度，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和

11、陽性藥銀杏葉提取物EGb761組，以假手術大鼠作為對照組，術后1～5天灌胃給藥，每日一次。提取分離給藥5天后MCAO大鼠缺血側(cè)大腦（除缺血核心區(qū)外），通過測定線粒體的氧化磷酸化功能、線粒體呼吸酶活性(琥珀酸脫氫酶SDH、細胞色素C氧化酶COX)、線粒體ROS含量、膜電位、線粒體PT孔的開放程度和ATP含量，研究小續(xù)命湯有效成分組對缺血再灌注大鼠線粒體功能的影響。同時，提取分離給藥5天后MCAO大鼠缺血半暗帶和核心區(qū)腦組織，Western

12、 Blot法檢測線粒體啟動的凋亡通路相關蛋白，包括Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax等，研究小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠線粒體凋亡相關蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥5天后，能夠顯著改善缺血再灌注大鼠腦線粒體的呼吸活力(P＜0.05，P＜0.01)，顯著提高線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性(P＜0.05），降低線粒體ROS的含量(P＜0.05，P＜0.01)，

13、明顯提高腦線粒體膜電位(P＜0.05）和促進腦組織ATP的合成(P＜0.05），但對腦線粒體膜腫脹度和細胞色素C氧化酶(COX)的影響不明顯。與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥5天后，能夠顯著下調(diào)促凋亡蛋白Bax，上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2(P＜0.05，P＜0.01);與此同時，小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著上調(diào)Caspase-3和Caspase-9，下調(diào)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9(P＜0.0