新型抗CD3小分子抗體的設(shè)計及其功能研究.pdf

1、抗CD3單克隆抗體OKT3自1986年被FDA批準(zhǔn)用于臨床以來，在腎、心臟、骨髓等實體及非實體器官移植后的抗排斥反應(yīng)中有著廣泛的應(yīng)用，近年來在Ⅰ型糖尿病等自身免疫病的治療中也取得了良好的臨床療效。但是抗CD3抗體與Fc受體相互作用引起的絲裂原活性以及鼠抗體的免疫原性給抗體的臨床應(yīng)用帶來嚴(yán)重的毒副作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者分別通過抗體人源化以及對抗體中參與與Fc受體相互作用的位點進行點突變來降低抗體的免疫原性和絲裂原活性，國外已有相應(yīng)的產(chǎn)品進

2、入各期臨床試驗，取得很好的臨床效果。因此，研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型無絲裂原活性的抗CD3抗體具有重要的理論和實際意義。 本論文在本室保存的抗CD3鼠源性單抗yCD3的基礎(chǔ)上，借助本實驗室建立的“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺，設(shè)計了新型的無絲裂原活性的抗CD3小分子抗體mini-yCD3，同時實現(xiàn)了抗體的部分人源化，并且對新型抗體的功能及作用機理進行了初步探討。具體研究結(jié)果如下： 1、釣取

3、了抗CD3鼠源性單抗yCD3的重輕鏈抗體基因，構(gòu)建表達了抗CD3嵌合抗體，對抗體的功能進行了初步鑒定。所構(gòu)建的抗CD3嵌合抗體可以與CD3<'+>細(xì)胞系Jurkat以及外周血單個核細(xì)胞PBMC特異性結(jié)合。在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中顯示了良好的免疫抑制活性。 2、借助“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺，優(yōu)化設(shè)計了新型小分子抗體mini-yCD3，其結(jié)構(gòu)模式為VH-Linker-VL-hinge-Human I

4、gG1 CH<,3> domain。利用距離幾何學(xué)、計算機圖形學(xué)技術(shù)對絞鏈區(qū)進行分析改造，使兩條mini-yCD3單鏈結(jié)構(gòu)通過絞鏈區(qū)的二硫鍵形成穩(wěn)定的雙價結(jié)構(gòu)。理論數(shù)據(jù)顯示，該小分子抗體可以與兩個CD3抗原結(jié)合，其作用模式與親本抗體相似。 3、通過在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達，獲得了小分子抗體mini-yCD3，在體外對該抗體的功能進行了驗證。結(jié)果與理論預(yù)測一致，該新型抗體在非還原條件下以二聚體形式存在，保持了與親本抗體一致的親和力

5、、免疫抑制活性以及下調(diào)T細(xì)胞表面CD3分子表達水平的能力；同時新型抗體沒有明顯地引起T細(xì)胞的活化，也未引起明顯的IL-2、IFN-γ等炎性細(xì)胞因子的釋放。也就是說，設(shè)計的新型小分子抗體mini-yCD3呈天然雙價結(jié)構(gòu)，保持了親本抗體的親和力和免疫抑制活性，大大的降低了抗體的絲裂原活性。 4、選擇T細(xì)胞活化途徑中的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：CD3分子ζ鏈的磷酸化以及Zap70的募集、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化和NFAT入核等，對新型小分子抗體與親

6、本抗體介導(dǎo)T細(xì)胞活化信號的差異進行分析，初步探討了不同結(jié)構(gòu)抗體介導(dǎo)T細(xì)胞不同活性的分子機制。鼠單抗yCD3的刺激可以引起CD3ζ鏈的充分磷酸化，而在小分子抗體mini-yCD3作用后，CD3ζ鏈的磷酸化水平僅維持在一個較低的水平。經(jīng)yCD3充分激活的CD3ζ鏈可以有效地引起ZAP70的募集活化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高、NFAT的入核以及IL-2的表達，最后導(dǎo)致T細(xì)胞的完全活化；而小分子抗體mini-yCD3雖然在高濃度作用下可以提高一定