激活PPAR-γ對ET-1誘導心肌肥厚及calcineurin-NFAT信號通路的影響.pdf

1、心肌肥厚(cardiachypertrophy)是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，心肌肥厚相關(guān)疾病如高血壓、心肌梗死等普遍存在且嚴重威脅人類健康。因為引起肥大刺激因素及所涉及信號通路的復雜多樣，介導心肌肥大的分子機制仍未明了，闡明這些信號通路對心肌肥厚的預防和治療將起重要作用。 研究表明，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高是各種病理刺激所致心肌肥大發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，而肥大基因的過度表達是心肌肥大的共同分子機制。近年研究表明，各種肥

2、大刺激引起心肌細胞內(nèi)鈣濃度升高可激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)信號通路。Calcineurin是一種Ca2+依賴的蛋白磷酸酶，被ET-1等肥厚刺激因素激活后去磷酸化底物NFAT3，促使其轉(zhuǎn)位入核，與GATA4結(jié)合調(diào)節(jié)心臟中ANF、BNP、α-MHC、β-MHC等基因的表達。研究表明Calcineurin/NFAT信號通路在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用。 PPAR-γ是屬于核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，近來研

3、究表明PPAR-γ，是心肌肥厚的負性調(diào)控物。研究報道PPAR-γ，激活劑可通過AP-1，STAT3以及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子阻止心肌肥厚。文獻報道，在T淋巴細胞及脂肪細胞，PPAR-γ與NFAT之間存在交叉對話?；赑PAR-γ與NFAT在其它細胞存在相互作用，我們設(shè)想在心肌細胞PPAR-γ激活后通過抑制calcineurin/NFAT信號通路負調(diào)控心肌肥大。 第一部分PPAR-γ過表達及羅格列酮對ET-1誘導乳鼠心肌細胞肥大的影響

4、 目的：以ET-1刺激培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞建立心肌肥大模型，觀察PPAR-γ過表達及羅格列酮對ET-1誘導心肌肥大反應(yīng)的作用，并探討ET-1誘導心肌肥大反應(yīng)的機制。 方法：采用MTT法、[3H]亮氨酸摻入法、細胞表面積測定法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、基因轉(zhuǎn)染等實驗方法，觀察了(1)在培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞使用羅格列酮與GW9662的安全濃度；(2)ET-1誘導培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞的肥大效應(yīng)；(3)

5、羅格列酮及過表達PPAR-γ對ET-1誘導的心肌細胞肥大及表型轉(zhuǎn)變的影響；(4)羅格列酮對ET-1誘導PPAR-γmRNA表達的影響。 結(jié)果： 1、本實驗中GW9662和羅格列酮的濃度分別為1、10μM，均為適用與新生SD大鼠心肌細胞的安全濃度。 2、1、10、100、1000nMET-1處理24h可劑量依賴性引起培養(yǎng)乳鼠心肌細胞蛋白質(zhì)合成([3H]亮氨酸摻入)增加，其中100nMET-1誘導蛋白質(zhì)合成增加較對照

6、組有極顯著性差異(P<0.01)。羅格列酮(10μM)和CsA(1μM)可抑制ET-1所致心肌細胞蛋白合成增加(Rosi，-70％，P<0.05；CsA，-59％，P<0.05)，且羅格列酮的效應(yīng)可被GW9662(1μM)所逆轉(zhuǎn)(+98％，P<0.05)。 3、100nMET-1可使心肌細胞表面積增加至約1.5倍，而羅格列酮(10μM)預處理可明顯抑制該效應(yīng)(-55％，P<0.01)，過表達PPAR-γ亦可抑制ET-1所致心肌細

7、胞表面積增加(-47％，P<0.01)。 4、100nMET-1刺激顯著誘導了ANF在心肌細胞的表達(1.8-foldvscontrol，P<0.01)。10μM羅格列酮預處理及過表達PPAR-γ,均抑制了ET-1促肥厚基因表達的作用(Rosi，-74％，P<0.01；PPAR-γ,-87％，P<0.01)。 5、100nM的ET-1刺激顯著降低了PPAR-γmRNA在心肌細胞的表達(-43％，P<0.01)，而10μM

8、羅格列酮預處理阻止了ET-1的這種作用(+89％，P<0.01)。 結(jié)論： 1、激活及過表達PPAR-γ可抑制ET-1誘導的心肌肥大反應(yīng)。 2、ET-1可通過下調(diào)PPAR-γ表達誘導心肌肥厚的發(fā)生。 第二部分激活PPAR-γ對ET-1誘導的乳鼠心肌細胞calcineurin/NFATc4信號通路的影響 目的：作為核受體PPARs的一種亞型，PPAR-γ的下調(diào)和滅活可能參與了高血壓左心室病變的發(fā)病過

9、程。盡管文獻報道PPAR-γ是心肌肥厚的重要調(diào)節(jié)因子，但是PPAR-γ激活后抑制心肌肥厚的機制尚未完全明了。本實驗采用PPAR-γ激動藥羅格列酮和pM-PPAR-γ質(zhì)粒作為干預藥物，研究了PPAR-γ激活后對ET-1誘導CaNmRNA、蛋白質(zhì)表達及酶活性的影響，以及對NFATc4核轉(zhuǎn)位的影響。探討激活PPAR-γ后抑制ET-1誘導的心肌肥大反應(yīng)是否通過calcineurin/NFATc4通路。 方法：本研究以ET-1刺激培養(yǎng)乳鼠

10、心肌細胞建立心肌肥大模型，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Westernblot)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)等方法，觀察了(1)羅格列酮對ET-1誘導的心肌細胞calcineurin酶活性的影響；(2)羅格列酮對ET-1誘導的心肌細胞calcineurinmRNA及蛋白表達的影響；(3)羅格列酮及過表達PPAR-γ對ET-1誘導的NFATc4核轉(zhuǎn)位的影響；(4)羅格列酮對PPAR-γ和NFATc4相互作用

11、的影響； 結(jié)果： 1、10、100、1000nMET-1分別使Calcineurin酶活性升高約1.8、3、2.5倍。10μM羅格列酮顯著抑制100nMET-1所致Calcineurin酶活性增高(-56％，P<0.05)，而GW9662可逆轉(zhuǎn)羅格列酮的作用(+88％，P<0.05)。 2、100nMET-1刺激24h后CalcineurinmRNA表達較對照組明顯增加(+61％，P<0.01)，羅格列酮預處理抑

12、制了ET-1所致CalcineurinmRNA增加(-48％，P<0.01)，而GW9662逆轉(zhuǎn)了羅格列酮的作用(+46％，P<0.05)。與對照組相比，ET-1刺激后Calcineurin蛋白表達明顯增加(+51％，P<0.01)，羅格列酮預處理抑制了ET-1所致Calcineurin蛋白增加(-37％，P<0.01)，而GW9662逆轉(zhuǎn)了羅格列酮的作用(+62％，P<0.01)。 3、ET-1刺激0.5h后心肌細胞中NFAT

13、c4開始進入細胞核。隨刺激時間延長，發(fā)生核轉(zhuǎn)位的心肌細胞數(shù)量增加，刺激3h和6h時最為明顯。羅格列酮預處理和PPAR-γ過表達阻止了ET-1誘導的NFATc4由胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位。羅格列酮預處理亦阻止了ET-1誘導的Calcineurin核轉(zhuǎn)位。 4、在心肌細胞中PPAR-γ和NFATc4之間存在相互作用，且羅格列酮可增強二者之間的相互作用。 結(jié)論： 1、ET-1可能通過激活calcineurin/NFATc4信號