環(huán)氧合酶-2(COX-2)促進胃癌發(fā)生發(fā)展相關分子的篩選和功能鑒定.pdf

1、【背景】
　　胃癌是世界范圍尤其是亞洲地區(qū)的常見惡性腫瘤，其發(fā)病機制目前尚不完全明確。研究顯示，環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase2,COX-2)在多數胃癌組織及細胞系中表達異常增高，它可以促進胃癌侵襲轉移及血管的形成，并且與胃癌的低生存率密切相關。而抑制COX-2的活性可以抑制胃癌相關的血管生成，而且能抑制胃癌細胞增殖，使凋亡增加，體內成瘤減小，前列腺素合成受到抑制。這提示COX-2與胃癌的發(fā)生發(fā)展關系密切，但其機制并不

2、清楚。蛋白質組學是近年來出現的能夠全貌性研究差異蛋白質表達的方法，雙向電泳聯合質譜鑒定技術是目前蛋白質組學研究的主流技術[1]，能夠有效地比較不同蛋白質組之間的差異，是查找特征性功能蛋白質、篩選蛋白效應分子和疾病相關標志物的有力手段。在本課題研究中，我們利用蛋白質組學的方法對COX-2siRNA及空載體轉染的SGC7901人胃癌細胞系進行比較蛋白質組學分析，以篩選與COX-2導致胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的蛋白質，并對下游分子進行功能鑒定，

3、還利用全基因組芯片和轉錄因子芯片對COX-2的下游效應分子進行了高通量的篩選，從而為揭示COX-2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機理、確定新的胃癌基因治療靶點及提供新的胃癌疫苗候選分子提供堅實的實驗基礎和理論依據。
　　【目的】
　　1、篩選COX-2促進胃癌發(fā)生發(fā)展的相關分子；2、研究目的分子15-羥基前列腺素脫氫酶與COX-2在胃癌中的相關性；3、研究15-羥基前列腺素脫氫酶在胃癌中的表達與臨床病理特征及臨床分期的關系，探討其在

4、胃癌發(fā)生和進展中的意義；4、觀察15-羥基前列腺素脫氫酶對胃癌細胞惡性表型的影響。
　　【方法】
　　1、采用雙向凝膠電泳技術、銀染顯色及PDQuest軟件分析篩選COX-2siRNA及空載體轉染的SGC7901胃癌細胞系中差異表達的蛋白質，而后用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)對表達存在顯著性變化的蛋白質進行檢測，將所得蛋白質肽質量指紋圖譜(PMF)行生物信息學分析；2、應用Westernblot

5、和免疫細胞化學的方法檢測COX-2和15-PGDH在COX-2siRNA載體和COX-2全長載體轉染的SGC7901胃癌細胞系中的表達；3、采用免疫組織化學和Westernblot技術檢測COX-2和15-PGDH在胃癌組織中的表達特征；4、分析COX-2與15-PGDH表達的相關性以及它們的表達與臨床病理參數的關系；5、通過基因重組方法構建15-PGDHsiRNA及15-PGDH全長載體，并分別穩(wěn)定轉染MKN45和SGC7901胃癌細

6、胞系；6、應用MTT實驗、流式細胞術、平板克隆實驗、軟瓊脂克隆形成實驗以及裸鼠體內成瘤實驗的方法研究15-PGDH對胃癌細胞生長和體內成瘤能力的影響；7、采用全基因組表達譜芯片和轉錄因子活性譜芯片篩選COX-2下游效應分子。
　　【結果】
　　1、蛋白質組學篩選出14個差異蛋白質
　　Westernblot技術檢測COX-2siRNA載體轉染SGC7901胃癌細胞后COX-2的表達，結果顯示，COX-2siRNA能顯著

7、下調COX-2的表達，其中以第1號siRNA的抑制效率最高。因此，我們采用第1號siRNA轉染的SGC7901胃癌細胞系作為研究對象。將細胞系樣品總蛋白質進行雙向電泳，通過軟件分析后，對22個表達明顯改變的蛋白質點用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)分析鑒定，獲得14個蛋白質的相應肽質量指紋圖譜(PMF)。其中，對比空載體轉染的SGC7901細胞，COX-2siRNA轉染的SGC7901細胞系中有7個蛋白顯著下調

8、，7個蛋白顯著上調。對PMF進行數據庫檢索，生物信息學分析鑒定出在COX-2siRNA轉染的SGC7901細胞系中下調的7個蛋白質是：細胞分裂周期蛋白16(Celldivisioncycleprotein16)，肌動蛋白γ(GammaActin)，14-3-3蛋白σ(14-3-3proteinsigma)，波形蛋白(Vimentin)，71kDa熱休克同源蛋白(Heatshockcognate71kDaprotein)，組胺-N-甲基轉

9、移酶(HistamineN-methyltransferase)，Ras相關蛋白Rab-3B(Ras-relatedproteinRab-3B)；而上調的7個蛋白質是：乳酸酰谷胱苷肽裂解酶(Lactoylglutathionelyase)，15-羥基前列腺素脫氫酶(15-hydroxyprostaglandindehydrogenase[NAD+])，補體成分1q亞成分結合蛋白(Complementcomponent1qsubcompo

10、nentbindingprotein)，生長分化因子2(Growthdifferentiationfactor2)，熱休克70kDa蛋白5(Heatshock70kDaprotein5)，磷脂酰肌醇轉移蛋白β亞型(Phosphatidylinositoltransferproteinbetaisoform)，應激蛋白70(Stress-70protein)。其中15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)是在COX-2siRNA轉染的胃癌

11、細胞中顯著上調的蛋白質之一，我們用Westernblot及免疫細胞化學檢測證實了這一結果。
　　2、15-PGDH在胃癌中表達降低并與COX-2表達呈負相關
　　我們應用Westernblot技術檢測8例胃癌手術組織標本中COX-2與15-PGDH的表達，發(fā)現與相應的癌旁組織相比，在胃癌組織中COX-2表達顯著升高，而15-PGDH的蛋白表達水平明顯降低甚至缺失；我們應用免疫組化技術檢測15-PGDH在55例胃癌患者手術標本

12、的連續(xù)石蠟切片中的表達，發(fā)現與正常胃粘膜上皮相比，15-PGDH在胃癌組織中表達顯著降低甚至缺失，而COX-2表達顯著增高；進一步分析COX-2及15-PGDH的表達與胃癌臨床病理特征的關系，發(fā)現15-PGDH在低分化胃癌中明顯低于高分化胃癌中的表達(p<0.05)；15-PGDH在TNMⅢ期和Ⅳ期患者的胃癌組織中的染色明顯低于于在Ⅰ期和Ⅱ期組織中的表達(p<0.05)；存在淋巴結轉移的胃癌組織中15-PGDH表達顯著低于無淋巴結轉移胃

13、癌組織中的表達(p<0.05)，而COX-2的表達與15-PGDH的表達模式相反。Spearsman相關性統計學分析顯示15-PGDH的表達與COX-2呈顯著負相關(rs=-0.564,p<0.01)。Westernblot和免疫細胞化學的方法檢測COX-2正義表達載體轉染的SGC7901胃癌細胞系COX-2和15-PGDH的表達，結果顯示COX-2正義載體能顯著提高COX-2的表達水平，而15-PGDH在COX-2正義轉染的胃癌細胞中

14、顯著下調。結果表明胃癌組織中15-PGDH的表達顯著降低，在低分化、TNM晚期和有淋巴結轉移的患者中表達更低，其表達與COX-2呈顯著負相關，且上調COX-2能抑制15-PGDH的表達，提示在胃癌中15-PGDH受到了COX-2的負調節(jié)。
　　3、外源性高表達15-PGDH可以降低胃癌細胞惡性表型，15-PGDH的特異性小干擾RNA可以促進胃癌細胞增殖。
　　Westernblot檢測了SGC7901、AGS、BGC823、

15、MKN45、MKN28五種胃癌細胞系和永生化正常胃粘膜上皮細胞GES中15-PGDH的表達，結果顯示15-PGDH在胃癌細胞系中的表達均低于GES細胞，在MKN45細胞中的表達相對較高，在SGC7901細胞中表達相對更低。我們用以色列的IdoWolf教授惠贈的15-PGDH正義表達載體穩(wěn)定轉染了SGC7901細胞，該正義載體能顯著提高SGC7901中15-PGDH的表達。15-PGDH的正義轉染可使SGC7901細胞體外增殖減慢，在平板

16、和軟瓊脂上形成克隆的能力降低，裸鼠體內成瘤性也降低，瘤體積明顯減小，生長減緩，流式細胞儀檢測顯示細胞阻滯于G1期。我們構建了15-PGDH的siRNA表達載體，并穩(wěn)定轉染了MKN45細胞，發(fā)現該siRNA能顯著抑制15-PGDH的表達，并能夠明顯促進MKN45在體外的生長增殖，在平板和軟瓊脂中形成克隆的能力及裸鼠體內的成瘤能力增強。上述結果提示，15-PGDH參與了胃癌細胞的生長、增殖等多種生物學行為的變化，且提高15-PGDH的表達能

17、降低胃癌細胞的惡性表型。
　　4、差異表達的轉錄因子及差異表達基因的篩選
　　利用核蛋白提取試劑盒(Piercebiotechnology)分別抽提COX-2siRNA和空載體轉染的SGC7901胃癌細胞的核蛋白，并用核酸蛋白檢測儀測定蛋白濃度。經轉錄因子活性譜芯片分析，以變化倍數1.5倍為標準判定差異表達的轉錄因子。結果發(fā)現，與對照細胞相比，SGC7901-COX-2/siRNA細胞中上調表達的轉錄因子有4個，下調表達的轉

18、錄因子有2個。
　　經過Trizol法抽提COX-2siRNA和空載體轉染的SGC7901胃癌細胞的總RNA，檢測顯示所提取的RNA符合基因芯片測定的要求。經芯片雜交、圖像采集及數據分析等步驟，以變化倍數2倍為標準判定差異表達基因。結果發(fā)現，與對照細胞相比，SGC7901-COX-2/siRNA細胞中上調表達的基因有1040個，下調表達的基因有234個。
　　【結論】
　　1、本研究通過比較蛋白組學技術篩選出不同COX

19、-2表達水平胃癌細胞系的差異蛋白質，這些蛋白質涉及細胞周期調控、細胞運動、細胞分化、細胞增殖及蛋白質轉運等諸多功能，可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉移過程中起到重要的作用；2、進一步對差異蛋白質15-PGDH的研究顯示15-PGDH在胃癌的發(fā)生和進展中起著抑癌基因的作用，并且受到COX-2的負調控，而且轉染15-PGDH全長的表達載體能夠提高胃癌細胞中15-PGDH的表達并在一定程度上逆轉胃癌細胞的惡性表型；3、用基因芯片和轉錄因子芯片篩選