反義轉化生長因子受體與反義基質金屬蛋白酶抑制因子聯(lián)合作用對肝纖維化的影響.pdf

1、背景：在我國肝纖維化發(fā)生率高,是肝硬化發(fā)展的必經環(huán)節(jié)。目前研究認為肝纖維化屬于可逆性病變,因此阻止和延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展則是治療肝硬化的關鍵。 研究發(fā)現(xiàn)在致肝纖維化的細胞因子中最重要是轉化生長因子β(TGF-β),其致纖信號傳導通路已闡明：首先活化了的TGF-β與II型TGF-β受體(TβRII)結合并使之磷酸化而具有激酶活性；與TGF-β結合的TβRII再結合I型TGF-β受體(TBRI)形成I、II型受體復合物,并使Tβ

2、RI磷酸化具有激酶活性；最后,激活的TβRI激活酶磷酸化其特殊的受體Smads(R-Smads),從而調節(jié)肝星形細胞(HSC)的轉化和ECM的合成、降解。即TGF-β發(fā)揮作用必須借助其在細胞膜上的跨膜受體TβRI和TβRII。故從理論上,可推測選擇性抑制TβRI的表達,應可影響TGF-β信號傳導,從而抑制TGF-β的促纖維化作用。 在正常肝臟中,基質金屬蛋白酶(MMPs)與基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)處于動態(tài)平衡的狀

3、態(tài),維持了膠原的產生與降解之間的平衡。當有損傷因子作用于肝臟,使HSC活化,打破了MMPs與TIMPs的平衡,就會導致膠原纖維降解的減少,致使大量的膠原在肝組織中沉積。肝內主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2,其中以TIMP-1表達更為顯著；主要存在的MMMPs在人類為MMP-1,在嚙齒類動物為MMP-13;TIMP-1可與MMP-1/MMP-13特異性結合,抑制其活性。故推測,抑制TIMP-1的表達,可減輕TIMP-1對M

4、MP-1/MMP-13的抑制作用,增加ECM的降解,減少ECM的沉積,延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。 本實驗旨在前期研究的基礎上,應用分子生物學檢測技術RT-PCR和western-bloting(蛋白印跡)測定各實驗模型組大鼠肝組織TBRI,TBRII和TIMP-1,MMP-13mRNA含量及蛋白的表達,并對所得數(shù)據(jù)進行科學分析,從生物分子的角度闡述并驗證本課題,反義轉化生長因子受體與反義基質蛋白酶抑制因子聯(lián)合作能夠有效的干預肝纖

5、維化的發(fā)生,發(fā)展。最終的目標是運用基因治療技術尋找一種防止和延緩各種慢性肝病向肝纖硬化發(fā)展的有效方法,為今后人類肝纖維化基因治療奠定基礎。 材料與方法：取-80℃低溫保存的實驗大鼠肝臟：正常對照組12例,模型對照組12例、空質粒組13例、反義TIMP-1真核表達質粒組13例,反義TβRI治療組13例,反義TβRII治療組13例,反義TβRI+反義TIMP-1治療組13例：反義TβRII治療組+反義TIMP-1治療組13例。

6、 1.運用RT-PCR半定量檢測肝組織內TβRImRNA、TβRIImRNA、TIMP-1mRNA、MMP-13mRNA測定。 2.western blot蛋白印記技術檢測大鼠肝組織中TβRI、TβRII、TIMP-1、MMP-13蛋白表達。 3.進行系統(tǒng)科學數(shù)據(jù)分析,論證。 結果：與模型對照組和空質粒組相比,反義TBRI治療組,反義TBRI+反義TIMP-1治療組、反義TIMP-1治療組、反義TβRⅡ治療組、

7、反義TβRⅡ+反義TIMP-1各治療組中的TβRI、TβRII及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表達均有下降,各組比對均有統(tǒng)計學意義。在正常對照組與各實驗治療組之間TβRI、TβR II及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表達均有顯著性差異；反義TβRI+反義TIMP-1治療組較反義TβRI治療組、反義TIMP-1治療組比對有統(tǒng)計學意義；反義TβRⅡ+反義TIMP-1各治療組較反義TβR II治療組,反義TIMP-1治療組比對有統(tǒng)計學意義

8、；模型對照組和空質粒對照組之間TβRI、TBRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表達則無顯著差異。 結論： 1、反義TβRⅠ、TβRⅡ真核細胞表達質粒通過阻斷TGF-β1的作用通道,減少細胞外間質(ECM)的合成,減輕肝纖維化的發(fā)展；通過實驗也驗證了TGF-β信號通路的存在。 2、反義TβRⅠ、TβRⅡ真核細胞通過阻斷FGF-β1的作用通道,對MMP-13產生抑制作用,對TIMP-1的促進作用,間接使細胞外間質