應用NT-3基因修飾的雪旺細胞與RA體外預誘導神經干細胞分化并聯合移植治療全橫斷脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、本研究旨在探討應用人NT-3基因轉染的雪旺細胞(SchwannCells，SCs)與維甲酸(retinoicacid，RA)體外預誘導神經干細胞(neuralstemcell，NSCs)分化并聯合移植對大鼠全橫斷脊髓損傷的治療作用，從而為急性脊髓損傷的治療探索一種新策略，本研究共分為四個部分。 第一部分神經干細胞和雪旺細胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 目的 改良出一種快速、簡單、經濟而又能得到足夠純度、足夠量的NSCs

2、和SCs的細胞培養(yǎng)方法，為研究應用NSCs和SCs提供穩(wěn)定、可靠的細胞來源。方法選用SD乳鼠，取海馬組織，用胰酶消化法和機械吹打法培養(yǎng)NSCs；取坐骨神經和臂叢神經，用單細胞雙酶消化法和半植塊單酶消化法培養(yǎng)SCs。結果用同樣多的材料，機械吹打法所獲得的NSCs是胰酶消化法所獲細胞的四倍，省時至少20min，免疫組化結果顯示獲得的神經干細胞呈nestin陽性；用同樣多的材料，半植塊單酶消化法所獲得的SCs比單細胞雙酶消化法所獲細胞至少多兩

3、倍，省時至少40min，免疫組化結果顯示獲得的雪旺細胞96％以上呈S-100陽性。結論用改良的機械吹打法培養(yǎng)NSCs；用單酶消化半植塊法培養(yǎng)SCs，能在短時間內獲得足夠量、足夠純度、生長狀態(tài)良好的NSCs和SCs。 第二部分雪旺細胞和維甲酸體外協(xié)同性促進神經干細胞向具有形成突觸潛能的神經元方向分化 目的 研究體外聯合應用SCs和RA對NSCs向具有形成突觸潛能的神經元方向分化的作用。方法采用2×2析因設計方法，N

4、SCs分別用RA，SCs和SCs+RA處理6d，所用培養(yǎng)液為含0.5％小牛血清的DMEM/F12。用免疫熒光雙標來檢測NSCs的分化情況，包括nestin，GFAP和Map2；PSD95的表達表明突觸的發(fā)生。結果與對照組相比，用RA或SCs處理后，nestin和GFAP的表達顯著下降，Map2的表達顯著增加，用SCs處理后，PSD95的表達顯著增加；析因設計的方差分析結果表明，SCs和RA在誘導Map2和PSD95的表達方面有顯著性交互

5、作用，且均有統(tǒng)計學意義。結論SCs和RA體外能協(xié)同性促進NSCs向具有形成突觸潛能的神經元方向分化，但在減少nestin陽性NSCs，減少NSCs向膠質細胞分化方面只是一種附加作用。 第三部分體外聯合應用人NT-3基因轉染的雪旺細胞與維甲酸促進神經干細胞向具有形成突觸潛能的神經元方向分化目的 研究體外聯合應用人NT-3基因轉染的SCs和RA對NSCs向具有形成突觸潛能的神經元方向分化的作用。方法RT-PCR方法檢測RA誘

6、導前后NSCs中trkCmRNA的表達情況；擴增、純化重組腺病毒，并檢測病毒滴度，用腺病毒載體介導的人NT-3基因(AdvNT-3)轉染SCs，用免疫組織化學法和ELISA法檢測NT-3的表達和分泌。NSCs分別用SCs，SCs+RA，AdvLacZ-SCs，AdvNT-3-SCs，AdvNT-3-SCs+RA和AdvLacZ-SCs+RA處理6d。用nestin、GFAP、Map2和PSD95免疫熒光雙標法來檢測NSCs的分化情況。結

7、果1.NSCs在RA誘導前后都有TrkC受體mRNA的表達；2.通過擴增、純化獲得了較高滴度的兩種重組腺病毒，至少達到1010pfu/ml；3.重組腺病毒載體能有效的轉染46.82％的雪旺細胞；4.在人AdvNT-3轉染第4、7、14d時每105細胞24h內分別可以產生約35.21±7.40ng、24.05±3.47ng、14.16±1.11ng的人NT-3因子。5.與SCs，AdvLacZ-SCs，SCs+RA組相比，用AdvNT-3

8、-SCs處理后，能顯著性減少GFAP的表達，能顯著性增加Map2和PSD95的表達；與其他組相比，用AdvNT-3-SCs+RA處理后，nestin和GFAP的表達顯著下降，Map2和PSD95的表達顯著增加，且均有統(tǒng)計學意義。結論聯合應用人NT-3基因轉染的SCs和RA能進一步促進NSCs向具有形成突觸潛能的神經元方向分化，同時減少nestin陽性NSCs，減少NSCs向膠質細胞的分化。 第四部分應用人NT-3基因轉染的雪旺細

9、胞與維甲酸體外預誘導神經干細胞分化并聯合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實驗研究目的 探討應用人NT-3基因轉染的雪旺細胞與維甲酸體外預誘導神經干細胞分化并聯合移植對大鼠全橫斷脊髓損傷的治療作用。方法取成年雌性SD大鼠37只，隨機分為5組，分別為：1.體外分化組，用人NT-3基因修飾雪旺細胞與維甲酸體外預誘導神經干細胞分化6d后再聯合移植；2.體外分化對照組，用LacZ基因修飾的雪旺細胞與維甲酸體外預誘導神經干細胞分化6天后再聯合移

10、植；3.體內分化組，將人NT-3基因修飾雪旺細胞與神經干細胞聯合移植后使神經干細胞在體內分化；4.實驗對照組，脊髓全橫斷后僅填充吸附培養(yǎng)液的明膠海綿；5.正常對照組，不做手術。采用脊髓胸10段全橫斷損傷模型，于全橫斷后在脊髓損傷處以明膠海綿為支架立即進行細胞移植，各組神經干細胞在移植前分別用Hoechst33342進行標記。術后53d時，在皮質體感區(qū)進行BDA順行標記；術后60d時，分別進行BBB評分和爬網格測驗，觀察各組大鼠后肢運動功

11、能的恢復情況；術后61d時，在脊髓橫斷下方胸12節(jié)段進行FG逆行標記；術后68d時進行灌注固定、取材及形態(tài)學觀察。結果1.中性紅染色后計數發(fā)現，與實驗對照組相比，各細胞移植組大腦皮質體感運動區(qū)內錐體細胞層、中腦紅核、及脊髓L1背核存活神經元數目均顯著增多，并有統(tǒng)計學意義。2.NT-3免疫熒光化學染色結果顯示，基因修飾SCs移植到損傷脊髓2個月后仍能表達外源基因。3.三個細胞移植組的脊髓橫斷處損傷區(qū)均檢測到由移植神經干細胞分化來的Map2

12、、NF、GFAP、PSD95、synapsin、ChAT染色陽性的細胞，并能檢測到nestin雙標陽性的細胞，其中Map2陽性細胞百分率，體外分化組最高，體內分化組最低，體外分化對照組介于兩者之間，三組之間兩兩相比均有統(tǒng)計學意義。4.與實驗對照組相比，三個細胞移植組的脊髓橫斷處及附近，均可看到多少不等的Map2、NF-200、GAP-43、5-HT陽性神經纖維，脊髓橫斷處檢測到少量BDA陽性神經纖維，但其尾側卻沒有，在中腦紅核和脊髓橫斷

13、處頭側端有少量神經元被FG標記。5.在三個細胞移植組的脊髓橫斷處MBP的表達缺如范圍明顯減少，CSPG的表達明顯減少。6.行為學檢測結果表明三個細胞移植組對脊髓損傷后大鼠后肢運動功能的恢復都有比較顯著的促進作用，與體外分化對照組相比，體外分化組大鼠后肢運動功能恢復更好一些，并有統(tǒng)計學意義。7.電鏡下，在細胞移植組中脊髓損傷處有少量再生的神經纖維軸突由厚薄不均的新生髓鞘包繞。結論應用人NT-3基因轉染的雪旺細胞與維甲酸體外預誘導神經干細胞