pGC-FU-存活素慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、背景及目的：
　　 我國(guó)是乙型病毒性肝炎高發(fā)地區(qū)，人群HBV攜帶率尤其較高，最終發(fā)展到乙型肝炎肝衰竭幾率較大。乙型肝炎肝衰竭多是在慢性乙肝病毒感染的過(guò)程中短期內(nèi)出現(xiàn)的大量肝細(xì)胞壞死，肝功能衰竭。因其病情發(fā)展迅速，病死率高，目前對(duì)該病尚無(wú)有效內(nèi)科治療。肝移植是治療的最終方案，而目前我國(guó)面臨嚴(yán)重的供體短缺和移植價(jià)格高昂等問(wèn)題。因此，乙型肝炎肝衰竭因嚴(yán)重影響人民的身體健康而一直受到臨床醫(yī)生和研究者重視。目前肝細(xì)胞移植一直是研究熱點(diǎn)，各

2、國(guó)學(xué)者通過(guò)不同途徑試圖探究能用于治療性移植的肝細(xì)胞。與其他途徑的細(xì)胞學(xué)治療相比較，經(jīng)基因?qū)W改造的原代肝細(xì)胞具有遺傳背景和生物學(xué)功能與正常肝細(xì)胞最相似，且惡變幾率較小，遺傳性狀易于保持等優(yōu)點(diǎn)。但原代肝細(xì)胞存在培養(yǎng)困難，壽命短，難以傳代，轉(zhuǎn)染率極低等局限性，所以，基因經(jīng)慢病毒介導(dǎo)感染細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染十分必要。
　　 存活素(survivin)是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，目前現(xiàn)有研究均提示survivin與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控存

3、在一定關(guān)系。對(duì)此，我們選擇構(gòu)建pGC-FU-survivin慢病毒質(zhì)粒，以期在下步實(shí)驗(yàn)中利用survivin蛋白的表達(dá)影響原代肝細(xì)胞的增殖。
　　 方法：
　　 1.從高表達(dá)survivin的小鼠淋巴瘤細(xì)胞株YAC-I中獲取存活素(survivin)基因，連接到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒上，雙酶切及雙向測(cè)序鑒定。
　　 2.構(gòu)建pGC-FU-survivin 慢病毒載體,從基因水平和蛋白質(zhì)水平鑒定含有surviv

4、in的目的片段表達(dá)。經(jīng)包裝，純化，獲得滴度較高的病毒顆粒進(jìn)行下一步生物學(xué)功能研究。3.將病毒感染小鼠原代肝細(xì)胞
　　 結(jié)果：1.雙酶切及測(cè)序證實(shí)從YAC-I中獲得的survivin基因連接到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒上，除第317位堿基由腺苷酸突變?yōu)樾叵汆奏ね?，其余都與NCBI基因文庫(kù)中survivin基因切合，該突變不影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)生理功能。
　　 2.構(gòu)建好的pGC-FU-survivin表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性克

5、隆菌株轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，Western-Blotting結(jié)果見一與標(biāo)準(zhǔn)品大小相同的條帶。在293T 細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，最終純化出pGC-FU-survivin慢病毒顆粒。
　　 3.pGC-FU-survivin 質(zhì)?？沙晒Ω腥拘∈笤渭?xì)胞，但因感染率仍未達(dá)到滿意要求，目前仍在改進(jìn)。
　　 結(jié)論：
　　 借助T載體及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，成功在pGC-FU慢病毒表達(dá)質(zhì)粒上