大鼠DnaJ樣蛋白rDJL的功能研究.pdf

1、　　精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜而有序的過程，在此過程中基因的表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)間性和空間性，正是這種受到嚴(yán)格時(shí)空調(diào)控的基因表達(dá)，使得睪丸干細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂最終分化、發(fā)育為成熟的精子。分離、克隆不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因，深入研究它們?cè)诰影l(fā)生中的作用，對(duì)于闡明精子發(fā)生機(jī)理和對(duì)人類的生殖健康、避孕疫苗的研制以及男性不育的防治均有重要意義。　　為深入研究rDJL基因的功能，我們對(duì)rDJL蛋白的編碼區(qū)C端進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆到原核細(xì)胞

2、表達(dá)載體pGEX-4T-3中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得了高效表達(dá)。利用大板膠切膠的方法純化GST-rDJL融合蛋白，以此為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備了高效價(jià)的抗rDJL蛋白多克隆抗體。用此抗體進(jìn)行Westernblot分析，在大鼠睪丸組織抽提液得到特異性較高的目的條帶，與rDJL預(yù)計(jì)分子量相符，能夠用來進(jìn)行rDJL蛋白的組織和亞細(xì)胞定位研究及進(jìn)一步的功能研究?！　∮米孕兄苽涞目箁DJL抗體進(jìn)行rDJL蛋自在睪丸組織的免疫組織化學(xué)定位研究。結(jié)

3、果顯示：rDJL從精母細(xì)胞時(shí)期開始表達(dá)，直到圓形精子細(xì)胞、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成熟精子，而在精原細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞和睪丸間質(zhì)組織則無rDJL表達(dá)。該結(jié)果與Northernblot發(fā)育表達(dá)譜的結(jié)果一致。制備生精細(xì)胞涂片做細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果進(jìn)一步明確了rDJL在生精細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位：在精母細(xì)胞中散在分布于胞漿中；在圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中呈偏一側(cè)的核旁定位；在成熟精子中定位于頂體區(qū)和精子尾部。構(gòu)建真核載體轉(zhuǎn)染模式細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)的rDJL