β-淀粉樣肽抑制劑的高通量篩選及阿爾茨海默癥β-淀粉樣肽病因學探究中新藥靶的尋找.pdf

1、第一章β-淀粉樣肽抑制劑的高通量篩選 阿爾茨海默癥(AD)是老年期發(fā)生的以進行性癡呆為特征的大腦變性疾病。由于AD形成的機制不明，現(xiàn)在在臨床上使用或試驗的藥品如膽固醇抑制劑，抗炎藥及膽堿酯酶抑制劑等，各針對不同的機制來治療，最多只能使病情減輕或不再惡化，還沒有可以完全治療的藥物和方法。AD細胞模型是在體外進行誘導，通過模擬AD腦中主要病變而建立的，在藥理學研究中主要應用于尋找防治AD藥物的作用靶位點，建立藥物篩選模型，在細胞、亞

2、細胞及分子水平上觀察藥物對病變的防治作用。海馬及皮層與學習記憶有關，也是發(fā)生衰老變化最早部位。AD病理改變主要發(fā)生于海馬和新皮層。因此選用原代培養(yǎng)的海馬及皮層神經元作為研究AD的細胞較為理想。但原代培養(yǎng)神經細胞相對難度大，周期長，所以我們同時采用具有神經細胞特性，又可穩(wěn)定傳代的人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y用于構建β-淀粉樣肽(Aβ)誘導退變的模型，快速篩選β-淀粉樣肽抑制劑。很多證據(jù)表明Aβ是誘導AD發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)，以Aβ誘導

3、的SH-SY5Y細胞株退行性病變是老年性癡呆疾病的一個較貼近的模型。我們實驗中建立了Aβ誘導的SH-SY5Y細胞株退行性病變模型用于高通量篩選Aβ抑制劑。 第二章Aβ誘導體外培養(yǎng)的皮層神經元退行性病變的基因表達譜分析 淀粉樣蛋白Aβ在腦內的累積，是AD疾病的重要發(fā)病機制之一，但是對于Aβ如何發(fā)揮其毒性，還缺乏足夠深入的了解。AD是多基因聯(lián)合調控的與衰老有關的神經系統(tǒng)退行性疾病。雖然它的主要病理特征已經明確，但是涉及其病理

4、過程的基因及其表達水平尚不確定。尤其與老年斑和神經元纖維纏積有關的主要成分來源于APP和Tau蛋白，它們本身都是正常機體的組成成分，具有一系列正常生理作用，導致其成為病理產物的因素則值得更加關注。在腦內Aβ的慢性累積過程中究竟發(fā)生了哪些分子水平的變化，通過對芯片結果的分析，顯示Aβ誘導神經元退行性變化可以在多條通路上起作用，正如AD疾病研究中發(fā)現(xiàn)的在AD病理過程中涉及到多種病理變化，包括內質網應激、膽堿能神經退變、自由基損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡

5、、細胞凋亡、免疫炎癥、線粒體機能障礙以及神經肽變化等，我們芯片的結果也顯示Aβ在體外培養(yǎng)的神經元作用幾乎能引起上述所有的病理生理改變，這從分子角度很好地證實了AD病因學發(fā)生的Aβ級聯(lián)假說，同時也給我們進一步研究AD提供了良好的基因靶標。 對差異表達的功能基因進行分析，芯片結果顯示Aβ作用能直接降低神經元抗應激能力。Aβ使熱休克蛋白表達普遍下調，提示AD發(fā)病過程中Aβ累積增多，使神經元抗應激能力下降，在不利環(huán)境下，細胞缺乏自身的保

6、護功能，容易誘導應激細胞壞死或凋亡發(fā)生。芯片的研究顯示Aβ下調谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PO)、CD36、白細胞介素-12P40前體蛋白表達等，減弱了神經元的抗應激能力。Aβ上調一氧化氮合酶表達，一氧化氮生成增多，使氧化壓力上升。Aβ通過抑制炎癥通路上相關蛋白的表達也使應激細胞生成熱休克蛋白、抗氧化酶類、免疫物質等下降，加劇了細胞損傷的發(fā)生。 GABAA介導的抑制效應可能是引起AD精神病理癥狀的重要原因。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)Aβ

7、能使3一羥基3一甲基戊二酰輔酶A還原酶表達上調，Aβ上調該酶的表達導致膽固醇合成增多很可能在AD發(fā)病過程中起到重要的作用。但顯然單純的膽固醇合成增多還不至于引發(fā)AD，膽固醇在中樞神經系統(tǒng)的進一步代謝很可能與AD發(fā)病有關。Aβ使GABAA受體pi亞基表達大幅上調，GABAA受體的pi亞基能與其它亞基結合改變受體對體內內源性類固醇物質的敏感性。我們推測Aβ誘導神經元膽固醇合成增加，改變神經類固醇物質的代謝活動，持續(xù)增強GABAA介導的抑制效

8、應，是引起AD精神病理癥狀的關鍵原因。 Aβ使卵泡抑制素上調(follistatingene，exon6，clonespROF上調1.69倍，follistatin上調1.75倍)、oxcytocin(Oxt)上調1.52倍、生長抑素Somatostatin(Sst)下調1.52倍。Aβ上調卵泡抑制素表達可能直接導致雌性激素水平下降，性激素替代療法在一定程度預防AD的發(fā)生和發(fā)展，也說明神經激素水平紊亂參與了AD的發(fā)病過程。干擾或

9、抑制卵泡抑制素的表達很可能對預防或治療AD有一定的作用。 Aβ增強PDE3B活性，上調其蛋白表達，可能與腦內脂質合成增加有關。而Myomegalin與PDE3B相互作用形成一種巨分子的復合物，錨定在細胞膜和各種細胞器質膜起作用。 副凋亡(Para-apoptosis)參與Aβ誘導的細胞程序性死亡。副凋亡是一種不同于凋亡的程序性細胞死亡方式。芯片結果顯示Aβ下調P物質及其受體的表達，提示Aβ誘導的神經細胞程序性死亡過程中發(fā)

10、生了神經肽P物質介導的副凋亡現(xiàn)象。Aβ使凋亡相關的Caspase-3、Nedd4及BCL2家族BH3作用區(qū)域凋亡激動劑Bid3基因表達下調。這表明Aβ可能并不能直接激活細胞的線粒體凋亡通路，相反在早期對凋亡的神經元有一定的保護作用。在AD病理晚期，據(jù)報道有較多的神經元凋亡發(fā)生，但一旦半胱天冬酶執(zhí)行程序處于適當位置，對下游如半胱天冬酶激活作用的干擾，其抑制作用恐怕不足以終止退行性病變過程，充其量只能延緩細胞凋亡，對治療AD難以取得好的效果

11、。 Aβ誘導神經細胞內部的“交通阻塞”，可能是阿爾茨海默氏癥的早期預兆。在我們實驗中發(fā)現(xiàn)Aβ能誘導神經元microtubule-associatedproteintau(Mapt)和serine/threonineproteinkinaseTAO2(Tao2)表達上調，可能與Tau蛋白在腦神經細胞內異常聚集形成神經纖維纏積(NFT)有關。Aβ能下調突觸后膜的PSD-95bindingprotein、vesicle-associa

12、tedmembraneprotein2(Vamp2)以及突觸前膜的突觸融合蛋白syntaxin5a(Stx5a)0.4713(后膜)表達。在我們的實驗中還顯示ADP-ribosylationfactor-like1(Arl1)、ADP-ribosylationfactor4(Arf4)、ADP-ribosylargininehydrolase全部下調，可能與細胞內物質轉運抑制有重要的關系。Lysosomalaminoacidtransp

13、orter1、Atp6b2、鈣網蛋白CRT、分泌顆粒素Scg2及轉運蛋白家族Slc12a1等基因表達改變也提示Aβ水平提高會影響受體蛋白的運輸，Aβ很可能通過調節(jié)內涵體輸送通路影響細胞表面受體的分布和作用。 第三章轉染衰老標志性鈣結合蛋白Rgn及神經激肽B受體Tacr3對Aβ1-42誘導PC12細胞退行性病變的保護作用 我們在用基因芯片技術研究Aβ誘導體外培養(yǎng)的皮層神經元退行性病變的基因表達譜改變時發(fā)現(xiàn)Aβ下調衰老標志性

14、鈣結合蛋白Regucalcin(Rgn)及神經激肽B受體tachykininreceptor3(Tacr3)的表達。我們利用大鼠的cDNA以PCR方法擴增Rgn及Tacr3基因片段，插入pIRESneo2真核表達載體，轉染PC12細胞，來觀察該基因在Aβ1-42引發(fā)AD發(fā)生的過程中可能起到的作用。 由于在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，我們購買的高度分化的PC12細胞在濃度高達2000μg/ml的G418中仍具有抗性，給篩選穩(wěn)定轉染的轉基因細胞

15、株帶來了困難。所以我們利用重組的pIRES-EGFP2載體觀察載體在PC12細胞中的表達和轉染效率，我們的結果顯示重組的pIRES-EGFP2轉染后48小時綠色熒光蛋白在PC12細胞中有很高的表達。推測重組的pIRESneo2-Rgn及pIRESneo2-Tacr3在PC12細胞中也能獲得高表達，另外瞬時轉染表達Rgn及Tacr3對PC12細胞存活率影響結果顯示Rgn轉染對照組，Tacr3轉染對照組及空載體轉染對照組細胞存活率沒有顯著性

16、差異。因此我們采用了較為簡便的瞬時轉染來研究Rgn及Tacr3的功能。 瞬時轉染表達Rgn及Tacr3對Aβ1-42誘導PC12細胞存活率的影響實驗結果顯示經20μMAβ1-42處理后，細胞增殖及存活能力下降，其中野生型Aβ1-42組細胞存活率下降至58.5％，空載體轉染Aβ1-42組細胞存活率為64.9％，兩者對Aβ1-42誘導的反應沒有顯著性差異。瞬時轉染表達Rgn及Tacr3能部分拮抗Aβ1-42的作用。結果顯示Rgn轉染

17、Aβ1-42組細胞存活率上升至71.8％，對比空載體轉染Aβ1-42組上升了6.9％，兩者有顯著性差異。Tacr3轉染Aβ1-42組細胞存活率上升至83.8％，對比空載體轉染Aβ1-42組上升了18.9％，兩者也有顯著性差異。經10μMAβ1-42處理后，野生型Aβ1-42組細胞存活率下降至68.2％，空載體轉染Aβ1-42組細胞存活率為70.9％，兩者對Aβ1-42誘導的反應沒有顯著性差異。結果顯示瞬時轉染表達Rgn及Tacr3能部分