水稻金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因OsMTP1的克隆與功能分析.pdf

1、　　本文采用電子克隆方法，以公布的小鼠鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因ZnT-2的氨基酸序列為信息探針，運(yùn)行BLAST程序搜索GenBank的水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，該探針與位于水稻第五條染色體上的重疊群Ctg010807高度同源，搜索EST庫(kù)并經(jīng)人工序列拼接、基因組結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件FGENSH-M分析，拼接獲得了1，685bp的水稻金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的cDNA序列，進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR的方法克隆了該基因的全長(zhǎng)cDNA,命名為OsMTP1。　　經(jīng)NCBI

2、序列搜索證實(shí)：OsMTP1是迄今為止唯一從單子葉植物克隆到的CDF成員。該基因只有一個(gè)外顯子，完整的ORF編碼418個(gè)氨基酸殘基，該cDNA全序列在GenBank中的登錄號(hào)為：AY266290。OsMTP1與其他CDF家族成員如AtMTP1、AsMTP1、TaMTP1、TgMTP1t1、TgMTP1t2、TmMTP1和PtdMTP1氨基酸的一致性為62～67﹪，相似性為70～77﹪。所有這些蛋白都有6個(gè)跨膜區(qū)(TM)，其中絕大多數(shù)都有富

3、組氨酸的可變區(qū)?！　“攵縍T-PCR分析的結(jié)果表明，OsMTP1在被檢測(cè)的水稻組織中呈組成性表達(dá)，但在葉中的表達(dá)要高于其他組織。不同濃度鋅處理時(shí)，OsMTP1的表達(dá)量隨鋅濃度的升高而增加。受過(guò)量鋅和鎘處理的水稻幼苗中，OsMTP1的表達(dá)顯著增加。當(dāng)植株受不同濃度Cu，F(xiàn)e，Mg處理時(shí)，OsMTP1的表達(dá)量稍有提高。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsMTP1::GUS融合基因轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中后，顯微觀察證實(shí)OsMTP1位于細(xì)胞的質(zhì)膜上。由此推

4、測(cè)OsMTP1的作用可能是將重金屬離子外排到細(xì)胞間隙中。　　通過(guò)構(gòu)建酵母表達(dá)載體，進(jìn)行OsMTP1的酵母表達(dá)分析。結(jié)果表明，在菌液濃度為OD600=0.5和0.05時(shí)，含pFL61-OsMTP1的菌株對(duì)150mMZnSO4的耐受性要明顯高于轉(zhuǎn)空載體pFL61的菌株，證明OsMTP1的表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因酵母耐鋅脅迫的能力。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pBI121-OsMTP1成功轉(zhuǎn)化進(jìn)煙草植株后，得到了6株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的植株，對(duì)其中兩株進(jìn)行