miR-127對肺癌進展的調控作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　通過體內外實驗證明miR-127參與肺癌的發(fā)生與發(fā)展；探明miR-127在肺癌中的重要調控功能；深入研究miR-127對于肺癌進展的分子調控機制。
　　方法：
　　1.分別用原位雜交和Real time PCR方法檢測人肺癌組織標本和不同人肺癌細胞系中miR-127的表達；分別建立miR-127過表達的PC9細胞和miR-127敲減的A549穩(wěn)定轉染細胞系，并用Real time PCR方法檢測穩(wěn)定轉染細胞

2、系中miR-127的變化水平。
　　2.Real time PCR和Western blot方法檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減miR-127后EM T相關的分子標志物的表達差異。
　　3.體外轉移和侵襲實驗檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減miR-127后，腫瘤細胞的轉移和侵襲能力的變化。
　　4.腫瘤干性實驗和軟瓊脂實驗檢測 PC9細胞過表達 miR-127和A549細胞敲減m

3、iR-127后，腫瘤細胞的腫瘤干性與克隆形成率。MTS和Western blot方法檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減miR-127后，對于Gefitinib誘導細胞凋亡的敏感性的變化，及對于Gefitinib所引起AKT和ERK的磷酸化水平的改變。裸鼠成瘤實驗檢測miR-127過表達的PC9細胞和miR-127敲減的A549細胞系與對照組相比的成瘤能力，用免疫組織化方法檢測Vimentin、Ki67、MMP9和TNF

4、AIP3在裸鼠腫瘤組織中的表達。
　　5.Real time PCR和Western blot方法檢測PC9細胞過表達miR-127和A549細胞敲減 miR-127前后，TNFAIP3的表達的變化；雙熒光素酶報告基因檢測 miR-127對TNFAIP3的直接靶向抑制作用。
　　6.Western blot的方法檢測PC9及A549細胞過表達及抑制miR-127前后，經(jīng)TNF-α作用后NF-κB信號通路相關蛋白IKKα/β、

5、IκBα及p65的磷酸化水平的變化及RIP1的K63泛素化水平的變化。
　　7.體外轉移實驗、侵襲實驗、MTS實驗及 Western blot的方法檢測 TNFAIP3對miR-127調控肺癌過程的作用。
　　結果：
　　1.人肺癌組織與人肺癌細胞系中，miR-127異常高表達。
　　2.PC9細胞過表達miR-127后，上皮細胞標志分子E-Cadherin顯著下調，間質細胞標志分子N-Cadherin、ZEB1

6、和Vimentin顯著上調。A549細胞敲減 miR-127后，上皮細胞標志分子E-Cadherin顯著上調，間質細胞標志分子N-Cadherin、ZEB1和Vime nt in顯著下調。
　　3.PC9細胞過表達miR-127后，細胞的轉移和侵襲能力顯著增加；而A549細胞敲減miR-127后，細胞的轉移和侵襲能力顯著減弱。
　　4.miR-127促進 PC9細胞的腫瘤干性，同時促進了體內腫瘤細胞的生長；而敲減miR-12

7、7的A549細胞腫瘤干性減弱，體內的腫瘤細胞生長減緩。Gefitinib降低PC9和A549細胞的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細胞的生長。miR-127過表達的PC9細胞與對照組相比，對于Gefitinib誘導細胞凋亡的敏感性降低，同時上調了AKT與ERK的磷酸化水平；而敲減 miR-127后，A549細胞凋亡增加，AKT與ERK的磷酸化水平顯著下調。miR-127上調 Vimentin、Ki67、MMP9等蛋白的表達，抑制TNFAIP3蛋

8、白的表達。
　　5.在穩(wěn)定過表達miR-127的PC9細胞系中，與對照組相比，TNFAIP3的表達明顯下調，在穩(wěn)定敲減miR-127的A549細胞系中，與對照組相比，TNFAIP3的表達明顯上調，雙熒光素酶報告基因實驗顯示miR-127可直接靶向抑制TNFAIP3的3’-UTR序列。
　　6.PC9細胞過表達miR-127后，與對照組相比經(jīng) TNF-α作用后NF-κB信號通路中IKKα/β、IκBα及 p65的磷酸化水平明顯

9、上調，RIP1的K63泛素化水平增強；而A549細胞抑制 miR-127表達后，與對照組相比經(jīng)TNF-α作用后IKKα/β、IκBα及p65的磷酸化水平明顯下降，RIP1的K63泛素化水平減弱。在 miR-127過表達的PC9細胞中轉染TNFAIP3真核表達載體后，miR-127所引起的NF-κB信號通路的變化有所回復。
　　7.在 miR-127過表達的PC9細胞中轉染 TNFAIP3真核表達載體，可抑制細胞的EMT、轉移和侵襲

10、能力；miR-127過表達的PC9細胞中轉染TNFAIP3真核表達載體，在 Gefitinib誘導下，miR-127對腫瘤細胞的抑制凋亡作用得到抑制，AKT與ERK的磷酸化水平有所回復。
　　結論：
　　1．肺癌組織中miR-127呈現(xiàn)顯著高表達。
　　2．miR-127促進肺癌細胞的侵襲、轉移、生長及上皮-間質轉化（EM T）。
　　3．miR-127可降低肺癌細胞對于Gefitinib誘導的細胞凋亡的敏感性。