人CYP2B6的體外表達及活性鑒定.pdf

1、細胞色素P450同工酶屬于血紅蛋白超家族,是參與催化眾多外源物和內源物生物轉化反應的重要酶系,主要存在于肝臟中。細胞色素P450酶系催化致癌物、環(huán)境污染物以及藥物的代謝,使這些化合物親水性或極性增加,促進排泄,防止毒性物質在體內累積。其中CYP1、2、3族負責大多數(shù)外源物的代謝,具有廣泛的底物特異性。細胞色素P4502B6,簡稱CYP2B6,是研究相對較少的同工酶,主要原因是一方面該酶在人肝中的mRNA水平和蛋白質含量比較低,另一方面是

2、缺乏合適的探針工具。隨著高靈敏度和選擇性的免疫檢測方法的應用,人們在人肝中檢測到CYP2B6較高的表達水平。近年來CYP2B6引起了更多的關注,越來越多的數(shù)據(jù)表明CYP2B6參與催化許多重要臨床藥物的代謝。其中安非他酮是CYP2B6的特異性藥物,可作為酶活性測定的探針底物。體外表達CYP2B6重組酶對研究該酶在藥物代謝中的作用具有重要意義。近年來桿狀病毒介導的昆蟲表達系統(tǒng)得到了廣泛地應用,本課題通過該系統(tǒng)表達CYP2B6重組酶,并進行活

3、性鑒定。
　　1.CYP2B6基因的克隆根據(jù)基因庫CYP2B6的cDNA序列設計引物,通過RT-PCR擴增得到CYP2B6的cDNA基因片段,cDNA片段與pGEM-T載體連接,重組質粒進行DNA測序。通過定點突變方法獲得野生型基因序列,經(jīng)測序的CYP2B6基因片段亞克隆到穿梭載體pFastBac載體上,該載體能夠與Bacmid發(fā)生特定位點的轉座重組。連接后的重組質粒CYP2B6-pFastBac轉化到含有Bacmid的大腸桿菌D

4、H10Bac感受態(tài)細胞中,通過藍白篩選獲得含有CYP2B6基因片段的重組粘粒,該重組粘粒通過脂質體法轉染昆蟲細胞,從而獲得重組桿狀病毒。
　　2.CYP2B6同工酶與CYPOR的共表達 將高滴度的CYP2B6病毒液和CYPOR病毒液共轉染Sf9細胞，表達體系中的血紅素濃度為3μg/mL。表達三至四天后，收獲細胞，細胞沉淀用PBS緩沖液洗滌后進行超聲破碎，即得到含有CYP2B6重組酶的細胞破碎液。3.表達產(chǎn)物分析細胞破碎液進行SDS

5、-聚丙烯酞胺凝膠電泳，將分離膠電轉移到PVDF膜上，用鼠His抗體和二抗分別先后室溫孵育1h，用PBS洗過后，用DAB法進行顯色。通過Western Blot法檢測到帶有his標簽的目的蛋白的表達。細胞破碎液進行超速離心后用CO-差示光譜法進行P450含量測定，沒有檢測到450nm處的吸收峰。4.活性鑒定采用CYP2B6的特異性底物安非他酮進行重組酶活性測定，在再生系統(tǒng)溶液中加入CYP2B6重組酶、系列濃度的底物進行孵育。按Linewe