CD44基因沉默對K562-A02細胞逆轉耐藥及生物學活性的研究.pdf

1、多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是導致白血病化療失敗的主要因為。多藥耐藥是指腫瘤細胞接觸一種抗癌藥物后產生的對多種結構和功能迥異的抗癌藥物的耐受性。目前認為它的發(fā)生機制是復雜多樣的,主要有:(1)多藥耐藥相關基因(如MDR1、MRP1、BCRP、LRP等)表達的上調；(2)凋亡相關基因(如BCL-2、BCR/ABL、P53等)表達的異常；(3)酶介導的耐藥,包括谷光甘肽轉移酶表達升高、DNA拓撲異構酶Ⅱ的含量

2、或活性降低；(4)增強的DNA修復功能；(5)微環(huán)境耐藥。其中以腫瘤細胞過度表達MDR-1基因編碼的ABC轉運蛋白超家族成員膜P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp,P-170,MDR1,ABCB1)為主要的機制。黏附分子CD44是一種細胞表面跨膜糖蛋白,作為透明質酸(HA)的受體,CD44分子的表達與白細胞的粘附、血管發(fā)生、細胞增殖、分化、遷移及淋巴細胞的活化、歸巢,以及免疫細胞的炎癥部位遷移和凝集有關。近年來,許多學者提

3、出CD44在正常髓細胞生成過程中發(fā)揮重要作用,CD44在造血細胞的過表達預示著血液惡性疾病預后不良。Vincent T等發(fā)現CD44分子與其受體HA之間的相互作用可能會影響惡性血液病細胞的存活及耐藥性。RNA干擾是利用雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘導序列特異的轉錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing)現象,由于其高效性,高特異性,高穩(wěn)定性,可遺傳性及RNAi

4、在有效地沉默靶基因的同時,對細胞本身的調控系統沒有影響等這些特點,越來越受到人們的重視。本研究以K562/A02細胞為研究對象,以RNAi技術為平臺研究CD44基因與耐藥細胞株K562/A02耐藥性的關系,為逆轉白血病多藥耐藥提供新的方法與思路。
　　 目的:構建針對CD44基因的RNA干擾表達質粒載體,探討CD44基因表達抑制對白血病多藥耐藥細胞株K562/A02耐藥性及生物學活性的影響。
　　 方法:根據CD44基因

5、表達序列設計有效的RNA干擾片段,將其構建入質粒表達空載體中,獲得針對CD44mRNA的特異性siRNA真核質粒(pGCsiRNA-CD44),轉染K562/A02細胞。用實時熒光定量RT-PCR檢測K562/A02細胞CD44,MDR-1和BCL-2mRNA的表達；MTT法檢測阿霉素對K562/A02細胞的半數抑制濃度(IC50)；流式細胞術(FACS)檢測細胞周期:Hochest33258染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化。

6、r>　　 結果:針對CD44基因的siRNA真核質?？捎行С聊琄562/A02細胞的CD44基因:與對照組相比,轉染了4條pGCsiRNA-CD44質粒的K562/A02細胞CD44表達均明顯抑制,以轉染了siCD44-1的細胞中抑制最強。轉染pGCsiRNA-CD44質粒48h后,K562/A02細胞CD44mRNA水平下降64.1％(p<0.05),同時MDR-1,BCL-2mRNA的表達量較對照組分別下降了25.6％,50.8％

7、；K562/A02細胞IC50為(17.97±1.61)μg/ml,無義序列質粒轉染后阿霉素對K562/A02細胞的IC50為(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44轉染后IC50明顯降低(8.77±1.63)μg/ml(p<0.01)。轉染48h后,G0/G1期細胞比例提高了10.7％,細胞出現核固縮、核邊集、凋亡小體等改變。
　　 結論:特異性CD44siRNA可顯著抑制K562/A02細胞CD44基因