自噬在神經突起退化過程中的作用及自噬溶酶體在突起內的動力學研究.pdf

1、神經元軸突和樹突（或統(tǒng)稱為“突起”）的退化是一個自我消亡的過程，其死亡方式有別于神經元胞體的凋亡，并在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中起著至關重要的作用。在眾多神經系統(tǒng)退行性疾病中，突起退化現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，且時常早于神經元胞體死亡，甚至會引發(fā)胞體死亡，導致患者的行為功能障礙。盡管如此，人們對于突起退化調控機制尚知之甚少。
　　 自噬是細胞的代謝方式之一，在饑餓條件下，細胞通過蛋白降解，使細胞質中物質和細胞器得以循環(huán)利用。研究結果表明，自噬與神經

2、退行性疾病有關，而自噬在這些疾病中起著促進細胞死亡還是維持細胞存活的作用，尚存在著爭議。而自噬是如何調控神經突起退化的也還不清楚。
　　 本課題通過運用小鼠頸上神經節(jié)(superior cervical ganglion，SCG)神經元，研究自噬在不同方式誘導的神經突起退化過程中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在體外瓦勒氏交性、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)剝奪以及微管干擾引發(fā)的交感神經元突起退化過程中，均伴隨

3、著自噬的誘發(fā)。突起退化時，自噬體/自噬溶酶體和瓦解的骨架蛋白—起堆積在突起串珠中。自噬誘發(fā)標志之一的微管相關蛋白輕鏈Ⅱ(microtubule-associated protein light chain3.Ⅱ，LC3-Ⅱ)的表達水平在突起退化早期顯著上調。而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)可以有效阻止突起活性的喪失，維持線粒體功能，并抑制突起退化現(xiàn)象。此外，通過RNA干擾下調自噬關鍵基因atg7和b

4、eclinl的表達水平顯著緩解了NGF剝奪導致的突起退化；低表達Atg7還可以抑制體外瓦勒氏變性誘發(fā)的突起退化。
　　 此外，在血清剝奪后的PC12細胞突起中，我們也同樣觀察到了自噬溶酶體的蓄積。利用熒光漂泊恢復技術，發(fā)現(xiàn)mRFP-LC3標記的自噬溶酶體在活細胞中是運動的結構。PC12細胞的實時熒光成像實驗進一步證實了自噬溶酶體在細胞內沿著突起作順向和逆向運輸，它們在運動過程中時常停頓，有時還會改變方向。通過計算機圖像處理，對自

5、噬溶酶體運動的特征參數(shù)進行了定量分析，研究發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體運動的平均速度與其囊泡大小相關，直徑大的自噬溶酶體運動相對緩慢；直徑較小的自噬溶酶體沿突起快速運動，2min內運動位移在5μm以上的囊泡順、逆向運動的平均速度分別約為0.33μm/s和0.39μm/s，而最快運動速度則分別可達1.22μm/s和1.51μm/s，2min內可跟蹤到的長距離轉運的囊泡連續(xù)運動50μm以上。微管干擾劑破壞微管結構后，自噬溶酶體停止運動，提示自噬溶酶體的運

6、輸依賴于微管。而添加分子馬達蛋白kinesin或dynein的阻斷劑也同樣影響著自噬溶酶體在突起內的順、逆向運輸。
　　 綜上所述，本課題的研究取得了以下創(chuàng)新性成果：①揭示了神經突起退化過程伴隨著自噬的誘發(fā)，自噬活性在突起病變早期顯著上升；②添加自噬抑制劑或下調自噬相關基因atg7或beclinl的表達，可有效延緩突起退化；③通過活細胞熒光成像技術，發(fā)現(xiàn)并記錄了自噬溶酶體在PC12細胞突起內進行順逆向快速運輸?shù)膭討B(tài)過程，運用計算

7、機圖像處理手段定量系統(tǒng)的分析了運動的特征參數(shù)；④運用熒光雙標記技術，直觀的顯示自噬溶酶體沿微管進行運動。分子馬達kinesin和dynein分別介導著自噬溶酶體的順、逆向運輸。本課題結合細胞分子生物學、活細胞熒光成像技術以及計算機圖像處理手段，系統(tǒng)闡述自噬在神經突起退化過程中的作用，并全面分析了自噬溶酶體在突起內的動力學特征，在國內外尚未見報道。研究結果提示自噬對神經元突起退化起著重要的調控作用，為更好地理解軸突和樹突死亡機制提供線索，