半邊旗提取物5F抗結腸癌的體內外實驗研究.pdf

1、結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例約800萬人，占所有惡性腫瘤的10％～15％;在歐美發(fā)達國家居惡性腫瘤發(fā)病率的前列，僅次于肺癌居腫瘤死亡原因的第二位。我國的研究顯示，結腸癌發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢，結腸癌發(fā)病率和死亡率分別為28.08/10萬和13.41/10萬，分別占惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位和第5位。雖然目前常規(guī)的治療手段在一定程度上緩解了病人的痛苦，延長了病人的生存時間，但還存在不少缺陷，如對于晚期患者，手術無能

2、為力，而且創(chuàng)傷大，而化學治療則面臨越來越頻繁的耐藥難題，藥物的毒副作用也使其臨床應用受到了限制。因此，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物是當今抗腫瘤研究的熱點，研發(fā)新的抗結腸癌藥物具有重要的現實意義。中醫(yī)藥治療腫瘤歷史悠久，是中華民族文化遺產的重要組成部分。應用中醫(yī)藥與中西醫(yī)結合治療結直腸癌等惡性腫瘤已經越來越被廣大腫瘤專業(yè)醫(yī)生和病人所接受，是目前結腸癌綜合治療中的重要組成部分之一?，F在臨床上主要應用于手術后、放療化療期間的減毒增效、西醫(yī)治療間歇

3、期的鞏固治療、晚期腫瘤的扶正治療，中醫(yī)藥都有積累了很多寶貴的經驗。臨床實踐證實，中醫(yī)藥和中西醫(yī)結合治療惡性腫瘤有以下優(yōu)勢:①有效改善臨床癥狀和生存質量，提高5年生存率;②加快術后的恢復如促進肛門排氣，降低術后并發(fā)癥如腹部手術后腸粘連;③對放療和化療期間合用有減毒增效作用;④提高人體免疫力，預防腫瘤復發(fā)轉移。中藥是新藥研發(fā)中的重要領域，許多中藥由于其低毒性及其巨大藥用價值，更是被廣泛用于藥物篩選。中藥作為抗癌藥物已愈來愈受到重視，許多中藥

4、活性成分及其分子靶點也已被鑒定。由于作用機制獨特，一些中藥活性成分對某些癌癥不僅表現出高度特異性及良好抗癌效果，而且毒副作用輕微，因此已成功進入臨床并且在腫瘤治療實踐中發(fā)揮了重要甚至關鍵作用，如紫杉醇及其衍生物的發(fā)現就是極佳證明。根據現代科技手段開發(fā)了很多中藥抗癌新藥已經在臨床上廣泛使用，如惹苗仁提取物康萊特注射液，復方斑鰲提取物艾迪注射液，香菇多糖注射液，黃茂多糖注射液等，以及提高免疫力的中成藥:補中益氣顆粒，河車大造膠囊，養(yǎng)血飲等都

5、與放化療合用。有關中西醫(yī)結合治療結直腸癌等腫瘤的臨床報道很多，清熱解毒，扶正固本、活血化淤等是常用療法，雖然單獨使用中藥抑瘤效果不及放化療，但是不良反應較少，它所具有的扶正作用和個體化治療是放化療所不能及的。
　　 半邊旗（Pteris Semipinnata L），別名半邊蕨、單片鋸、半邊牙、半邊梳、半邊風藥，系鳳尾蕨科植物，為南方民間常用中草藥，始載于《嶺南采藥錄》，性味苦、辛，涼，歸肝經、大腸經，具有清熱解毒，消腫止痛的功

6、效，常用于治療腸炎、菌痢、肝炎和結膜炎等。課題組經研究發(fā)現半邊旗的水提物和醇提物均能有效抑制腫瘤細胞的生長，對小鼠移植瘤有明顯抑制作用。通過對半邊旗粗提取物的分離純化得到具有強抗腫瘤活性的貝殼杉烷型二萜類化合物5F（ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid）]。目前已發(fā)現半邊旗提取物5F對白血病、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌和胰腺癌等多種癌細胞有明顯抑制作用，對小鼠S180肉瘤、

7、淋巴肉瘤及HepA肝癌均有明顯抑制作用，能降低NNK誘導的肺癌和DEN誘導的肝癌的數量和大小。其抗腫瘤機制可能與誘導癌細胞凋亡、細胞周期阻滯有關;可抑制NF-κB信號通路，從而抑制癌基因Bcl-2和Bcl-xL的表達，刺激誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，下調增殖相關蛋白(Cyclin D1、COX-2和EGFR)和凋亡相關蛋白(Survivin)的表達，促進凋亡抑制蛋白Bax表達，誘導癌細胞死亡;通過p53介導的線粒體途徑，促進B

8、ax基因表達，使線粒體釋放細胞色素C及凋亡誘導因子(AIF)到胞漿，引起細胞凋亡;影響MAPK通路的ERK1/2、JNK和p38基因的表達，從而調控細胞凋亡和細胞周期;對高轉移卵巢癌、高轉移肺癌等癌細胞有降低其侵襲和轉移能力的作用，這與下調VEGF、MMP-9和uPA表達，上調PTEN的表達有關。這些實驗結果提示了5F在抗腫瘤應用中的廣泛前景，為5F的開發(fā)利用提供了可靠的實驗依據。盡管5F在藥效學及其作用機制的研究中做了大量的工作，但其

9、確切作用機制仍未明確。因此我們希望進一步深入研究半邊旗提取物5F在體內外對結腸癌的作用并探討其作用機制，為5F作為結腸癌的預防或治療用藥提供理論和實驗依據。本研究分為四個部分：
　　 第一章：5F對C26結腸癌細胞增殖的影響。
　　 目的：觀察5F對結腸癌細胞株C26細胞生長抑制情況。
　　 方法：采用臺盼藍染料排斥實驗測定不同濃度的5F干預24、48和72h后對細胞生長的影響;四唑鹽(MTT)分析法來檢測其對細

10、胞活力的影響;[3H]-胸腺嘧啶摻入實驗分析其對細胞DNA合成的影響。實驗結果主要采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，方差齊時采用Tukey HSD進行多重比較，方差不齊采用Tamhane's T2進行多重比較，多因素采用析因分析比較各處理方式的主效應及交互效應。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：⑴在臺盼藍染料排斥實驗中，5F能夠顯著抑制C26細胞的增殖，且呈現劑量依賴關系和時間依賴關系。5、10、20、4

11、0和80μg/ml5F作用24h，細胞生長抑制率分別為4.75±3.38％、15.13±8.26％、40.72±3.39％、68.52±4.27％和87.16±6.73％，10、20、40和80μg/ml劑量組與對照組相比差異具有顯著性;作用48h，細胞生長抑制率分別為28.48±8.22％、52.78±4.36％、66.37±3.56％、81.16±6.22％和95.62±3.62％，差異具有顯著性;作用72h，細胞生長抑制率分別為4

12、0.71±4.37％、62.79±3.23％、81.78±5.57％、96.19±2.29％和98.95±0.61％，差異具有顯著性。⑵MTT分析實驗顯示，5F能夠顯著抑制細胞活力水平，且呈現劑量依賴關系和時間依賴關系。5、10、20、40和80μg/ml5F作用24h，細胞活力抑制率分別為2.75±2.38％、8.57±5.68％、37.12±6.38％、75.65±5.97％和87.64±3.75％，10、20、40和80μg/ml

13、劑量組與對照組相比差異具有顯著性;作用48h，細胞活力抑制率分別為25.59±7.61％、55.91±5.75％、76.14±4.38％、89.06±3.22％和97.22±0.24％，10、20、40和80μg/ml劑量組與對照組相比差異具有顯著性;作用72h，細胞活力抑制率分別為35.89±3.67％、68.29±1.11％、79.18±2.98％、90.89±3.29％和97.95±0.12％，差異具有統(tǒng)計學意義。⑶[3H]-胸腺

14、嘧啶摻入實驗表明，5F可以顯著抑制C26細胞DNA合成，且呈現時間依賴關系和劑量依賴關系。5、10、20、40和80μg/ml5F孵育24h，C26細胞的DNA合成率分別為DMSO對照組的96.01±6.35％、89.34±5.29％、70.12±5.53％、41.57±1.92％和29.23±6.73％，10、20、40和80μg/ml劑量組與對照組相比差異具有顯著性;孵育48h，細胞DNA合成率分別為DMSO對照組的85.79±3.

15、96％、61.08±8.13％、32.22±4.72％、18.83±2.08％和10.78±1.29％，差異具有顯著性;孵育72h，細胞DNA合成率分別為對照組的72.37±2.62％、51.98±6.21％、26.53±1.99％、10.41±4.23％和6.54±2.04％，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：5F能夠顯著抑制C26細胞的增殖、細胞活力以及DNA合成，并呈現劑量依賴關系和時間依賴關系。
　　 第二章：5F

16、對C26結腸癌細胞周期、細胞凋亡及相關調控蛋白的影響。
　　 目的：觀察5F對結腸癌細胞株C26細胞周期和細胞凋亡的影響，并檢測細胞周期調控蛋白和細胞凋亡調控蛋白的變化，初步探討5F抑制C26細胞生長的可能機制。
　　 方法：對細胞進行PI染色，利用流式細胞儀檢測細胞的DNA含量，進而評價5F對C26細胞周期分布的影響。使用annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞儀定量分析磷脂酰絲氨酸外翻程度從而檢

17、測5F作用后細胞凋亡比例的變化。進行Western blot實驗，分析細胞周期相關蛋白以及細胞凋亡相關蛋白表達量的變化。使用caspase-3、caspase-8和caspase-9分光光度法檢測試劑盒，通過酶標儀檢測caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。對細胞周期及凋亡相關蛋白CDK1、Cyclin B1、p21、p53、Bax、Bcl-2和caspase-3、8、9結果的比較采用獨立樣本T檢驗，其余實驗結果

18、采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，若方差不齊，采用校正的F檢驗Welch法代替。多重比較方差齊時采用Tukey HSD，方差不齊采用Tamhane' sT2。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：⑴5F能夠誘導C26細胞發(fā)生G2/M周期阻滯，而且這一效應具有劑量依賴性和時間依賴性。10μg/ml和20μg/ml5F孵育24h，G2/M期比例由9.60±1.32％分別升高到15.49±1.70％和35.20±4

19、.80％;孵育48h，G2/M期比例由6.59±1.27％分別升高到19.37±5.80％和41.75±3.94％，差異有統(tǒng)計學意義。20μg/ml5F孵育6h、12h、24h和48h后，G2/M期比例由8.81±1.99％分別上升到16.47±1.33％、21.61±2.07％、33.14±3.26％和40.06±3.82％，差異具有顯著性。⑵C26細胞經annexin V-FITC/PI雙染后，流式細胞儀分析顯示，C26細胞分別與5

20、μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml5F孵育24h后，晚期凋亡細胞所占比例分別為1.98±0.46％、4.33±0.58％、7.93±0.31％和8.07±0.80％，早期凋亡細胞所占比例分別為4.33±0.78％、5.05±0.52％、8.53±0.46％和17.08±0.75％，發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例分別從5.15±0.46％升高到6.32±0.58％、9.38±0.90％、16.47±0.59％和2

21、5.15±1.20％，差異具有顯著性。⑶20μg/ml5F孵育24h，CDK1、Cyclin B1的表達降低，CDK1的表達水平為對照組的73.10±6.95％，Cyclin B1的表達水平為對照組的62.45±5.73％;p21、p53的表達增加，p21的表達水平為對照組的254.17±26.95％，p53的表達水平為對照組的704.90±15.73％; Bax蛋白表達水平為對照組的414.94±18.95％，Bcl-2蛋白表達量為對

22、照組的46.90±5.73％，Bax/Bcl-2比例由0.95升高到8.45; caspase-3活性由0.211±0.067增加到0.398±0.095，caspase-9活性由0.201±0.039增加到0.518±0.084，差異具有統(tǒng)計學意義。caspase-8的活性沒有明顯變化。
　　 結論：①5F能夠誘導C26細胞發(fā)生G2/M周期阻滯，而且這一效應具有劑量依賴性和時間依賴性。②5F能夠誘導C26細胞凋亡，而且這一效應

23、具有劑量依賴性。③5F使細胞周期關鍵調控蛋白CyclinB1和CDK1蛋白表達降低，抗凋亡的Bcl-2蛋白表達量下調而促進凋亡Bax蛋白表達量上升，導致Bax/Bcl-2比例升高，p21和p53的表達增加，caspase-3和caspase-9活性增加而caspase-8的活性沒有明顯變化。
　　 第三章：5F抗癌作用與cAMP信號傳導通路的關系研究。
　　 目的：觀察5F對C26結腸癌細胞環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的影

24、響，探討該變化與5F抗腫瘤作用之間的關系。
　　 方法：以不同時間、不同濃度5F處理C26細胞，放免法測定cAMP含量。磷酸二酯酶抑制劑3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)預先孵育后再與5F聯合應用，放免法檢測cAMP含量，MTT法檢測C26細胞活力。統(tǒng)計方法主要為單因素方差分析(ANOVA)，多重比較方差齊時采用Tukey HSD，方差不齊時采用Tamhane's T2，多因素采用析因分析比較各處

25、理方式的主效應及交互效應。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：⑴20μg/ml5F分別作用于C26細胞5、10、20和30min，cAMP含量分別為1.43±0.11 pmol/mg、1.77±0.16pmol/mg、2.13±0.12 pmol/mg和2.10±0.16pmol/mg，隨著作用時間逐漸延長，cAMP含量逐漸增加，差異具有統(tǒng)計學意義。⑵5、10、20、40μg/ml5F作用于C26細胞20min，cAM

26、P含量分別為對照組的116.08±7.27％、143.60±5.56％、166.76±9.28％和201.09±13.51％，隨著5F劑量增加，cAMP含量逐漸提高，差異具有統(tǒng)計學意義。⑶最大劑量的廣譜磷酸二酯酶抑制劑IBMX0.5 mM預先孵育15min，然后再加入不同濃度5F孵育15min，結果顯示，0.5 mM IBMX組cAMP含量為對照組的251.72±12.70％(P＜0.01);5μg/ml和10μg/ml5F組cAMP含

27、量為對照組的124.71±8.01％和163.51±8.02％(P＜0.01);而IBMX分別與5μg/ml、10μg/ml5F聯合應用，cAMP含量分別為對照組的294.83±9.08％和341.38±14.24％(P＜0.01)，IBMX與5F兩者之間沒有交互效應。⑷0.5 mM IBMX預先孵育15min，然后再加入不同濃度5F孵育48h，結果顯不，0.5 mM IBMX組細胞存活率為74.57±3.53％(P＜0.01)。與單獨

28、使用5F相比，5μg/ml5F和IBMX聯合應用可以使C26細胞存活率由70.47±6.89％降低到55.28±1.45％(P＜0.01)，10μg/ml5F和IBMX聯合應用可以使C26細胞存活率由43.83±2.66％降低到26.88±4.32％(P＜0.01)，IBMX與5F兩者之間沒有交互效應。
　　 結論：①5F可以增加C26細胞cAMP含量，而且這一效應具有劑量依賴性和時間依賴性。②5F可能通過激活腺苷酸環(huán)化酶(AC

29、)增加C26細胞cAMP含量。③在抑制C26細胞增殖方面，5F與IBMX沒有交互效應。
　　 第四章：5F對結腸癌動物模型腫瘤生長的影響。
　　 目的：觀察5F對C26結腸癌荷瘤小鼠和DMH/DSS誘導的結腸炎相關性結腸癌小鼠腫瘤生長的影響，以及5F對肝腎功能的影響，研究5F的體內抗腫瘤效應及毒副作用。
　　 方法：通過腋下接種C26細胞建立結腸癌荷瘤小鼠模型，觀察5F作用后小鼠體重和腫瘤重量的變化。聯合應用致癌

30、劑DMH和致炎劑DSS建立結腸炎相關性結腸癌模型，觀察小鼠體重、腫瘤數量和大小的變化，檢測血AST、ALT、BUN和Cr的含量。對DMH/DSS誘導的結腸癌模型中平均腫瘤數量和腫瘤大小的比較采用獨立樣本T檢驗，其余實驗結果的比較采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，方差齊時采用Tukey HSD進行多重比較，方差不齊采用Tamhane' sT2進行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：⑴C26結腸癌荷瘤

31、動物模型:5F50mg/kg和100mg/kg劑量組實驗動物治療后的體重略高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義;在腫瘤重量方面，模型組平均瘤重為1.29±0.22g，5F50 mg/kg和100 mg/kg劑量組平均瘤重分別為0.76±0.19g和0.45±0.12，明顯低于模型組，差異具有顯著性。腫瘤抑制率分別為41.38％和64.87％。⑵DMH/DSS誘導的結腸炎相關性結腸癌模型:模型組小鼠共發(fā)現腫瘤49個，平均每只小鼠有腫瘤5.44±

32、1.33個，腫瘤平均大小為3.22±1.1mm;5F組共發(fā)現腫瘤35個，平均每只小鼠有腫瘤3.5±1.08個，腫瘤平均大小為2.51±0.85mm，5F組腫瘤的數量和大小均低于模型組(P＜0.01)。⑶模型組和5F組小鼠AST分別為正常對照組的117.28±17.17％和109.8±18.75％，較正常對照組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義，ALT分別為正常對照組的135.11±24.88％和126.85±22.08％，明顯高于正常對照組，