磷脂爬行酶1在結(jié)直腸癌組織中的表達及其生物學功能的研究.pdf

1、磷脂爬行酶1(phospholipidscramblase1，PLSCR1)是一種Ca2+結(jié)合的Ⅱ型膜蛋白。最初的研究認為，PLSCR1的主要功能是參與在細胞激活、損傷或者凋亡過程中發(fā)生的膜磷脂重新分布。但近來發(fā)現(xiàn)，PLSCR1的生物學功能并不局限于細胞膜磷脂跨膜活動，甚至有研究顯示PLSCR1與磷脂跨膜活動并沒有充分或者必要的聯(lián)系。盡管PLSCR1確切的生物學功能目前尚不明確，但是有越來越多的證據(jù)表明，PLSCR1可能參與細胞的增殖、

2、分化和凋亡過程，并在信號傳遞中發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸腺癌組織中，有報道PLSCR1的表達水平高于正常腸粘膜，此外，與健康個體相比，早期和進展期結(jié)直腸癌患者血漿中PLSCR1水平明顯升高，且早期患者升高更明顯，COX回歸模型顯示PLSCR1高表達提示患者預后較差，但其具體作用機制尚不明確。因此，本研究對磷脂爬行酶1在結(jié)直腸癌組織中的表達及其生物學功能進行了研究。
　　目的:探討PLSCR1的表達與結(jié)直腸癌生物學行為及預后的關(guān)系，研究

3、沉默PLSCR1的基因?qū)Y(jié)直腸癌細胞增殖、粘附、遷移和侵襲等行為的影響，探討通過PLSCR1靶點對裸鼠移植瘤增殖和侵襲的抑制作用及其機制。期望通過以上實驗，為結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展提供預測指標及潛在治療靶點。
　　方法:
　　1.應用免疫熒光細胞化學方法分析PLSCR1在結(jié)直腸癌細胞株中的表達情況，同時應用免疫組織化學方法分別檢測結(jié)直腸癌及其肝轉(zhuǎn)移癌組織中PLSCR1蛋白的表達，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　

4、2.使用Western-blot和反轉(zhuǎn)錄PCR方法從蛋白和基因水平檢測PLSCR1在結(jié)直腸癌組織中的表達情況，復蘇凍存的PLSCR1蛋白和基因水平表達相對較高的和相對較低的結(jié)直腸癌組織進行原代細胞培養(yǎng)，使用細胞侵襲實驗(Transwell)方法檢測PLSCR1表達差異明顯的結(jié)直腸癌原代細胞的侵襲能力。
　　3.設計三條RNA干擾片段及一條陰性對照片段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達PLSCR1的結(jié)直腸癌細胞株，采用Western-blot和實時定

5、量PCR方法驗證干擾結(jié)果，篩選出對PLSCR1蛋白抑制率最高的干擾片段，通過細胞粘附實驗來評估轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌細胞粘附能力的變化，通過遷移和侵襲實驗來評估轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲能力的變化。
　　4.建立荷瘤動物模型，通過siRNA瘤內(nèi)及瘤周注射的方法研究抑制腫瘤細胞增殖效應的在體實驗，探討PLSCR1對裸鼠移植瘤增殖和侵襲的抑制作用及其機制。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光細胞化學檢測顯示:PLSCR1在所培養(yǎng)的4株

6、結(jié)直腸癌細胞株中均有表達，主要定位在結(jié)直腸癌細胞的細胞膜上，其中細胞株Lovo和HR8348表達相對細胞株Colo-320和Sw620更強。免疫組織化學方法檢測顯示:PLSCR1在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移癌組織中的表達率顯著高于正常粘膜。PLSCR1陽性表達與遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，PLSCR1表達陽性者術(shù)后5年生存率相對較低。
　　2.復蘇人結(jié)直腸癌凍存組織進行原代細胞培養(yǎng)可以得到存活的腫瘤細胞用于臨床科學研究。Western-blot顯示:PL

7、SCR1蛋白在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達水平顯著高于正常結(jié)直腸黏膜標本。反轉(zhuǎn)錄PCR顯示:PLSCR1mRNA的相對含量在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的水平顯著高于正常結(jié)直腸黏膜標本。細胞侵襲實驗(Transwell)檢測發(fā)現(xiàn)，分化程度相仿，PLSCR1表達較高的結(jié)直腸癌原代細胞穿膜細胞數(shù)顯著高于PLSCR1表達相對較低的結(jié)直腸癌原代細胞。
　　3.體外構(gòu)建的3對RNA干擾片段siRNA/390、siRNA/851、siRNA/911均可抑制PL

8、SCR1蛋白的表達，驗證實驗顯示，siRNA/390干擾片段抑制效果最明顯。進一步實驗表明，siRNA/390干擾下調(diào)PLSCR1的表達后，結(jié)直腸癌細胞株Lovo增殖變緩，粘附、遷移、侵襲能力下降。
　　4.成功建立了結(jié)直腸癌裸鼠皮下移植瘤動物模型。局部多點瘤內(nèi)及瘤周注射PLSCR1siRNA-LipofectamineTM2000復合物可顯著抑制裸鼠移植瘤的增殖和侵襲。對移植瘤進行免疫組織化學方法檢測顯示:PLSCR1及EGFR