人sCR1結合功能域片段基因的克隆與表達.pdf

1、國內外的研究證實,過度活化的補體片段介導的嚴重創(chuàng)(燒)傷后并發(fā)機會病原菌感染、缺血再灌注損傷等疾病,除了C5a之外還有C3a和C5b-9等成分的共同作用.所以,只針對某一種補體活化片段的防治研究顯然是局限的.在經典、旁路和MBL三個補體激活途徑中,都以C3活化為中心,小分子sCR1(SCR15-18)既可滅活C3/C5轉化酶,又能結合C3b,并且還能輔助I因子裂解C3b,阻斷C5a和C5b-9等片段的生成.該文為了構建原核表達質粒pET

2、32-sCR1-SCR15-18,獲得具有生物學活性的sCR1結合功能域片段,采取從人外周血單核細胞中提取總RNA,以RT-PCR法克隆sCR1結合C3b功能域(SCR15-18)基因片段;再將目的基因插入pMD18-T載體中進行核苷酸序列鑒定;構建到原核表達載體pET32a,轉化入表達宿主菌BL21,經抗性篩選與陽性重組子酶切鑒定后;再用IPTG誘導表達,用鎳柱純化目的蛋白;并觀察表達產物抑制補體溶血反應活性.研究取得了以下主要結果:

3、1.從人外周血單核細胞中提取總RNA,并以此為模板設計引物,經RT-PCR成功地克隆了編碼人補體受體I型胞外區(qū)sCR1-SCR15-18的cDNA(其長度為753bp),連接于T-載體后測序,經查對與GenBank上登錄的編碼相應補體受體I型胞外區(qū)cDNA的序列完全一致.2.將測序正確的目的片段插入原核表達質粒pET32,成功地構建了重組原核表達質粒pET32-sCR1-SCR15-18.氨芐青霉素篩選出陽性重組子的質粒經酶切鑒定確認.

4、3.將上述質粒轉化大腸桿菌BL21,經IPTG誘導,均獲得了較高水平的表達,并確立sCR1在大腸桿菌中高效表達的最佳誘導表達條件為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導表達4小時.4.經Ni<'2+>-NTA純化系統及尿素分步透析,表達蛋白得到了有效純化和復性,純化蛋白在SDS-PAGE上呈現單一條帶.5.生物學活性分析顯示,所純化的目的蛋白能抑制補體的溶血反應.綜上所述:該實驗成功的構建了原核表達質粒pET32-sCR1-SCR1