藥物過量時激活PXR介導調控藥物代謝酶與轉運體轉錄促進毒物消除的解毒機制研究.pdf

1、研究目的:
　　1.基于“上調MDR1基因、誘導P-gp外向轉運解除中樞抑制藥物中毒”的機制研究，采用ATP酶活性測試法，考察待測藥物對P-gpATP酶活性的影響，明確藥物是否為P-gp底物，初步建立臨床中毒多發(fā)的中樞抑制藥物P-gp底物譜，從而明確適合該中毒解救治療方案的藥物。
　　2.采用藥物跨膜雙向轉運法，考察待測中樞抑制藥物在血腦屏障上的轉運特性，并進一步確證P-gp是否參與這些藥物在血腦屏障上的轉運。
　　3

2、.考察在常規(guī)劑量與中毒劑量下，藥物本身對大鼠肝臟、前額葉皮質與海馬中PXR信號通路調控Ⅰ相代謝酶CYP3A4和Ⅲ相轉運體P-gp的影響，并考察藥物過量中毒情況下給予PXR激活劑對大鼠肝臟、前額葉皮質與海馬中PXR、CYP3A4與P-gp的mRNA與蛋白表達水平的影響，從而揭示通過激活PXR信號通路調控藥物代謝酶與轉運體協(xié)同促進藥物消除的分子機制，以期為開辟新的藥物中毒救治途徑奠定基礎，為研究新型解毒藥物提供新的思路。
　　研究方法

3、:
　　1.經(jīng)文獻調研，很多中樞抑制藥物均為P-gp的底物或調節(jié)子。以建立中樞抑制藥物P-gp底物譜為目標，制定研究藥物的入選標準并納入待研究藥物。建立ATP標準曲線后，以P-gp ATP酶抑制劑四氧嘧啶作為陰性對照，以P-gp ATPase誘導劑維拉帕米作為陽性對照，用多功能酶標儀檢測高、中、低濃度的待測化合物的熒光強度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得到△RLUbasal與△RLUTC值并比較二者的大小，考察待測藥物對P-gp ATPase活性

4、的影響。
　　2.采用人腦微血管內皮細胞與人星形膠質細胞共培養(yǎng)的方式建立人血腦屏障體外模型，并對模型特征進行評價，通過MTT法確定各藥物對細胞的無毒濃度范圍，建立并驗證細胞轉運液中各待測藥物的定量分析方法，以P-gp熒光性探針底物Rh-123作為陽性對照，采用雙向轉運法考察入選的中樞抑制藥物跨血腦屏障的轉運特性，并考察P-gp抑制劑對藥物跨血腦屏障轉運的影響，進一步確證P-gp是否參與這些藥物在血腦屏障上的轉運。
　　3.選

5、擇喹硫平為中毒的模型藥物，選擇SD大鼠為中毒模型動物，選擇地塞米松為核受體PXR的誘導劑。SD大鼠隨機分為4組，即空白組（Control組），喹硫平常規(guī)劑量組(Normal組)，喹硫平中毒未干預組(Toxic組)，以及喹硫平中毒地塞米松干預組(Toxic+Dex組)，按分組進行不同處理后，于預先設定的時間點采集大鼠的肝臟、前額葉皮質與海馬，利用Real-time PCR與Western-blot分子生物學技術，考察不同時間點各組大鼠的肝

6、臟、前額葉皮質與海馬中核受體PXR、Ⅰ相代謝酶CYP3A4、Ⅲ相轉運體P-gp的mRNA與蛋白表達水平，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　研究結果:
　　1.舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭組的RLU值均大于維拉帕米組，推測這3個藥物對P-gp的親和力比維拉帕米弱。舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭其ΔRLUTC均小于ΔRLUbasal，推測其可能為ATP酶抑制劑，可能會通過抑制ATP酶活性而抑制P-gp;高、中、低濃度的舒必利、齊拉西酮、西酞

7、普蘭的RLU值無明顯差異，推測其對P-gp的抑制作用無濃度依賴性。高濃度的佐匹克隆與嗎氯貝胺其RLU值小于維拉帕米組，由此推測其在反應過程中消耗ATP較多，故與P-gp的親和力較強;不同濃度的氯米帕明、中、低濃度的佐匹克隆與嗎氯貝胺的RLU值大于維拉帕米組，對P-gp的親和力比維拉帕米弱。佐匹克隆、氯米帕明、嗎氯貝胺在高濃度時△RLUTC大于△RLUbasal，在中、低濃度時其△RLUTC小于△RLUbasal，由此推測這3個藥物在高濃

8、度時對P-gp有誘導作用，在中、低濃度時可通過抑制ATP酶的活性從而抑制P-gp。
　　2.采用人腦微血管內皮細胞與人神經(jīng)星形膠質細胞共培養(yǎng)方式所建立的體外血腦屏障模型具有高致密、低通透、表達轉運體等特征，建立較為快速、靈敏、特異的藥物濃度測定方法用于跨膜雙向轉運實驗，結果顯示，與陽性對照Rh-123所得結果相似，低、中、高濃度的舒必利與西酞普蘭的Papp(A-B)＜Papp(B-A)且ER＞2，B→A方向的轉運高于A→B方向的轉

9、運，表現(xiàn)出極性轉運特征，推測舒必利和西酞普蘭為血腦屏障上P-gp的底物。當加入P-gp抑制劑后，低、中、高濃度的舒必利與西酞普蘭的Papp(A-B)值增大，Papp(B-A)值減小，所得ER值接近1，提示當P-gp轉運功能受到抑制時，P-gp底物雙向轉運失去極性轉運特性，該結果進一步證明P-gp介導舒必利和西酞普蘭在體外血腦屏障上的雙向轉運。研究還發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度的嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明Papp(A-B)值略高于Papp(B-

10、A)值且ER＜1，提示嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明不具有極性轉運特征，不是P-gp的底物;當加入P-gp抑制劑后，低、中、高濃度的嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明的表觀滲透率(Papp)未發(fā)生顯著變化，所得ER值仍然小于1，該結果提示P-gp抑制劑維拉帕米對嗎氯貝胺、佐匹克隆和氯米帕明的轉運沒有影響，P-gp不參與其在體外血腦屏障上的轉運。
　　3.腹腔注射給予大鼠常規(guī)劑量喹硫平后，大鼠的肝臟、前額葉皮質與海馬中核受體PXR、藥物代謝

11、酶CYP3A4和藥物轉運體P-gp的基因與蛋白表達水平高于空白組;腹腔注射給予大鼠常規(guī)劑量與中毒劑量喹硫平后，QTP中毒未干預組(Toxic組)的大鼠肝臟、前額葉皮質與海馬中PXR、CYP3A4、P-gp的表達水平高于QTP常規(guī)劑量組(Normal組);腹腔注射給予大鼠中毒劑量喹硫平后，QTP中毒DEX干預組(Toxic+Dex組)大鼠肝臟、前額葉皮質與海馬中PXR、CYP3A4、P-gp的表達水平高于QTP中毒未干預組（Toxic組）

12、。Toxic+Dex組大鼠體內PXR-藥物代謝酶CYP3A4/轉運體P-gp信號通路上調更快。
　　結論:
　　1.舒必利、齊拉西酮、佐匹克隆、氯米帕明、西酞普蘭及嗎氯貝胺均為P-gp底物（或抑制劑），其中，舒必利、齊拉西酮、西酞普蘭為非濃度依賴的ATP酶抑制劑，高、中、低濃度的各藥物對ATP酶的抑制作用無明顯差異;佐匹克隆、氯米帕明與嗎氯貝胺為濃度依賴的ATP酶雙向調節(jié)劑，在高濃度時可誘導ATP酶活性，對P-gp具有誘導作

13、用，中、低濃度時可抑制ATP酶活性，對P-gp具有抑制作用。
　　2.雙向轉運實驗結果提示，舒必利與西酞普蘭為P-gp的底物，P-gp介導其跨血腦屏障的轉運;嗎氯貝胺、氯米帕明與佐匹克隆不是P-gp的底物，P-gp不參與其跨血腦屏障的轉運。結合ATP酶活性測試所得結果，推測嗎氯貝胺、氯米帕明與佐匹克隆可能是P-gp抑制劑。將所得研究結果與文獻調研結果相結合，成功建立中樞抑制藥物P-gp底物（毒物）譜，明確了適合“上調MDR1誘導P

14、-gp表達增加中樞抑制藥物外排”這一解救治療方案的藥物，為臨床藥物中毒的解毒治療提供了新的依據(jù)和手段。
　　3.喹硫平可自我誘導核受體PXR-藥物代謝酶CYP3A4/轉運體P-gp這一信號通路，當藥物過量時藥物的這種自我誘導效應更為明顯，并且核受體PXR激動劑可協(xié)同性地上調信號通路下游的藥物代謝酶CYP3A4與轉運體P-gp的基因與蛋白表達水平。在藥物過量中毒時，激活PXR可快速有效激活解毒系統(tǒng)，從而可能達到快速清除體內毒物以及保