組織工程化靜脈瓣構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù).pdf

1、原發(fā)性瓣膜功能不全是臨床上常見病，多發(fā)病，靜脈瓣移植被認為是最后的選擇。但自體靜脈瓣移植來源有限，限制了靜脈瓣移植的應用，應用細胞生物學與工程學原理開發(fā)出具有生物活性、無免疫原性的組織工程化靜脈瓣是修復與功能重建深靜脈功能不全的理想方案。
　　 目前構(gòu)建組織工程化靜脈瓣研究處尚處于起步階段。Teebken等(2003)應用組織工程學原理，用受體靜脈壁來源的肌纖維母細胞和內(nèi)皮細胞構(gòu)建組織工程化靜脈瓣，但是肌纖維母細胞沒能長入支架內(nèi)

2、部；該課題組在2009年又以人大隱靜脈內(nèi)皮細胞為種子細胞，大隱靜脈脫細胞支架為支架材料，構(gòu)建組織工程化靜脈瓣，三維立體培養(yǎng)8天，發(fā)現(xiàn)細胞能在瓣膜兩側(cè)和血管壁表面生長并內(nèi)皮化，但該研究血管壁內(nèi)沒種植細胞，沒有進行體內(nèi)移植。
　　 我們實驗室在國家、軍隊和上海市基金的資助下，近年來一直進行組織工程化靜脈瓣的研究，我們已[1]利用骨髓來源的多能成體祖細胞(Multipotentadultprogenitorcells，MAPC)和內(nèi)皮

3、祖細胞(Endothelialprigenitorcell，EPC)作為種子細胞，以綿羊脫細胞靜脈瓣支架為支架材料，成功構(gòu)建了組織工程化靜脈，并進行了犬、綿羊在體效用性研究，及安全性評價。但是，靜脈瓣在體內(nèi)長期功能欠佳，我們認為，其原因可能與瓣膜的內(nèi)皮化程度、內(nèi)皮細胞體內(nèi)黏附強度、脫細胞支架材料在制備過程中損傷、變性等因素有關(guān)。擬提高組織工程化靜脈瓣的質(zhì)量，縮短與生理性靜脈瓣的差距，優(yōu)化構(gòu)建程序，有必要對組織工程化靜脈瓣的構(gòu)建中所用材料

4、和構(gòu)建技術(shù)進行再探討。
　　 在種子細胞研究方面，我們實驗室利用骨髓源性MAPC和EPC為種子細胞，成功構(gòu)建了組織工程化靜脈瓣，但是，細胞分離培養(yǎng)過程復雜，需采用全骨髓血培養(yǎng)加免疫磁珠分選，免疫磁珠價格昂貴、不經(jīng)濟，細胞分選過程復雜，易污染。為優(yōu)化組織工程化靜脈瓣構(gòu)建程序、降低成本，有必要對種子細胞的種類及分離培養(yǎng)方法進行再研究。
　　 在支架材料制備方法上，先前的研究采用了兩種不同的脫細胞支架制備方法，但其中哪一種方法

5、較好還未曾研究。近期有研究報道的凍融+生物酶的方法，在其他組織脫細胞支架制備中對支架材料結(jié)構(gòu)損傷小，但目前該方法還未見在靜脈瓣膜脫細胞支架制備中應用。在支架材料制備方法上，我們先前的研究采用TritonX-100+NH40H+DNase+RNase的脫細胞方法，支架無細胞殘留，纖維連續(xù)，支架內(nèi)布滿大小不等的孔隙，無免疫原性。但利用該支架材料構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣體內(nèi)長期功能欠佳，這是否與該脫細胞方法有關(guān)尚不得而知。近期研究報道，凍融+生

6、物酶的方法在其他組織脫細胞中發(fā)現(xiàn)對支架材料結(jié)構(gòu)損傷小，利用該方法制備的瓣膜脫細胞支架是否能提高組織工程化靜脈瓣體內(nèi)長期功能，也值得研究。
　　 在種子細胞種植方法上，我們先前的研究采用多點注射和加壓灌注的方法，程序復雜、需要較高的專門技術(shù)、且發(fā)現(xiàn)利用該方法構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣體內(nèi)超過6個月，有內(nèi)皮細胞脫落、血栓形成的現(xiàn)象，嚴重影響了組織工程化靜脈瓣的體內(nèi)長期功能，迫切需要尋找新的方法。
　　 本研究針對我們組織工程化靜

7、脈瓣研究中遇到到的問題，擬通過簡化種子細胞誘導培養(yǎng)方法，獲取活性好，純度高的種子細胞；獲得一種脫細胞完全、對支架材料結(jié)構(gòu)損害較小的組織工程化靜脈瓣脫細胞支架的方法；以及研發(fā)平滑肌細胞種植器，提高平滑肌細胞粘附率等三個方面的研究；以提高組織工程化靜脈瓣的構(gòu)建效果，改善組織工程化靜脈瓣遠期性能。
　　 第一部分，同時培養(yǎng)兔骨髓源性EPCs和SPCs
　　 研究目的：
　　 同時分離和培養(yǎng)兔骨髓來源的EPCs和平滑肌祖

8、細胞(Smoothprogenitorcells，SPCs)，研究其生物學特性，評估其作為組織工程化靜脈瓣種子細胞的可能性。
　　 材料和方法：
　　 密度梯度離心法獲取兔骨髓血單個核細胞沉淀，分別用含5％FBS的EGM-2完全培養(yǎng)基向EPC方向誘導培養(yǎng)；用含5％FBS，20ng/mlPDGF-BB，不含VEGF的EBM-2培養(yǎng)基向SPC方向誘導培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)48h后首次換液，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征，透射電鏡觀察兩

9、類細胞超微結(jié)構(gòu)的特點。誘導第7天，14天細胞免疫熒光、流式細胞儀檢測EPCs/SPCs表面標志陽性率表達情況；檢測細胞攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1功能，以及在MatriGel上成血管功能情況，將第3代細胞進行凍存和復蘇，測定細胞凍存前后的細胞活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 EPCs生物學特性：EPCs培養(yǎng)10天左右，細胞單層融合呈“鋪路石”狀；EPC表達CD34，VEGFR-2，弱表達CD133；透

10、射電鏡可見EPCs胞漿內(nèi)特征性W-P小體；細胞生物學功能檢測可見EPCs在Matrigel上呈現(xiàn)血管狀；EPCs具有攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的功能。凍存細胞復蘇前后細胞生長特性方面無明顯變化；SPCs生物學特性：SPCs培養(yǎng)14天左右出現(xiàn)血管平滑肌特異的生長特征“峰-谷”樣生長特性；表達CD34，SMA，不表達Ⅷ和VEGF-2；在透射電鏡下可見細胞內(nèi)含有與細胞縱軸平行排列的肌絲；無攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合

11、FITC-UEA-1功能；在Matrigel上無血管狀結(jié)構(gòu)形成。
　　 結(jié)論：
　　 骨髓血梯度密度離心得到的單個核細胞，在不同誘導培養(yǎng)基的誘導下，可同時獲到高純度的EPCs和SPCs，SPCs可自然分化為平滑肌樣細胞，不需要經(jīng)向平滑肌細胞誘導分化，省時、經(jīng)濟、不易污染。
　　 第二部分，不同方法制備組織工程化靜脈瓣脫細胞支架
　　 研究目的：
　　 比較三種不同方法制備的帶瓣靜脈脫細胞支架的組織

12、學，生物學特性，以期獲得一種較好的帶瓣靜脈脫細胞支架材料。
　　 材料和方法：
　　 采用以下三種不同方法制備帶瓣靜脈脫細胞支架。
　　 1.脫氧膽酸鈉組：Beagle犬帶瓣靜脈，浸入4％去氧膽酸鈉溶液，4℃振蕩1h進行脫細胞處理，然后于37℃以50mL生理鹽水反復沖洗，得到脫細胞帶瓣靜脈支架，于4℃PBS液中保存?zhèn)溆茫?br>　　 2.Triton組：Beagle犬帶瓣靜脈，浸入0.5％Triton-100+

13、0.05％NH40H溶液，4℃振搖3d；超純水4℃振搖3d；DNase+RNase處理(37℃)12h；超純水漂洗，將脫細胞支架60CO輻照消毒，-80℃保存?zhèn)溆茫?br>　　 3.凍融+生物酶組：Beagle犬帶瓣靜脈，浸入4℃低滲液浸泡11小時，-80℃3小時，37℃水浴30min，PBS振蕩沖洗。0.05％胰酶+0.02％EDTA處理8h，DNase0.2mg/mL、Nase0.02mg/mL消化8h，PBS漂洗，上述步驟重復3

14、次，支架材料冷凍干燥，輻照消毒，-80℃保存?zhèn)溆茫?br>　　 隨機選取各組支架材料檢測，病理切片分別行HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)；掃描電鏡觀察支架材料表面及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；透射電鏡DAPI染色觀察DNA殘留；體外EPCs細胞種植檢測細胞相容性。
　　 結(jié)果：
　　 三種脫細胞方法均能徹底去除細胞，DAPI熒光檢測顯示各組支架材料細胞核，均無DNA成分殘留；HE染色及掃描電鏡顯示，凍融+生物酶組膠原纖維排列整齊，未見明顯的膠原

15、纖維結(jié)構(gòu)改變，其他兩組可見膠原纖維斷裂，及結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象；與其他兩組脫細胞支架材料相比凍融+生物酶組支架皮下埋置炎細胞浸潤較少，EPCs與凍融生物酶組支架材料粘附性好。
　　 結(jié)論：
　　 結(jié)合滲透壓改變的反復凍融加上低濃度胰酶，核酸酶脫細胞法，既可以較徹底除去帶瓣膜靜脈細胞成分，又保留了較完整的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有良好的組織和細胞相容性，是較理想的帶瓣膜靜脈脫細胞支架制備方法。
　　 第三部分，平滑肌種植器構(gòu)建組

16、織工程化靜脈瓣
　　 研究目的：
　　 研制平滑肌細胞種植器，并利用該裝置種植SPCs，加壓灌注旋轉(zhuǎn)種植EPCs，以提高細胞的種植率，構(gòu)建性能良好的組織工程化靜脈瓣。
　　 材料和方法：
　　 平滑肌細胞種植器的研制：改革傳統(tǒng)的從官腔內(nèi)種植平滑肌細胞的方法，利用真空吸引的作用將平滑肌細胞從官腔外壁較均勻的種植平滑肌細于在內(nèi)膜下。組織工程化靜脈瓣構(gòu)建：選第3代SPCs/EPCs為種子細胞，實驗組用自制的平滑

17、肌種植器種植SPCs：對照組用加壓灌注多點注射的方法種植SPCs。培養(yǎng)三天后，以加壓灌注種植EPCs，繼續(xù)培養(yǎng)四天。SPCs種植4h，冰凍切片，DAPI染色觀察SPCs種植密度；24h掃描電鏡、甲苯胺藍染色觀察SPCs在支架材料上的粘附情況；MTT檢測、細胞粘附實驗檢測種子細胞在支架材料內(nèi)的增殖性能。一周后HE染色，免疫組織化學染色觀察構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣的組織學結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 平滑肌種植器種植的細胞密度較

18、均勻、支架材料內(nèi)膜層結(jié)構(gòu)破壞較小、種植平滑肌細胞的數(shù)量可進行量化控制；在無菌的細胞懸液筒中進行，減少了構(gòu)建過程中的污染幾率。種植4h后DAPI染色顯示，實驗組SPCs種植密度均勻，對照組細胞種植密度不均勻，僅局部有細胞聚集。掃描電鏡顯示，實驗組血管外表面細胞粘附較多，已有少量的細胞外基質(zhì)分泌，支架材料表面平滑；對照組有少量細胞粘附，支架材料表面有蜂窩狀。甲苯胺藍染色顯示，實驗組SPCs在支架材料上粘附較多，細胞密度較大。MTT、細胞粘附