MicroRNA-106b在喉癌中對RUNX3表達的調控及其機制研究.pdf

1、喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其全世界發(fā)病率呈逐年增長趨勢。目前喉癌的治療方法主要是手術治療，雖然人們一直致力于對喉癌早診斷、早治療，并在切除癌腫的前提下，盡可能保留或重建喉的功能，但是，患者術后仍有不同程度發(fā)音障礙和吞咽困難，影響到患者生存質量。為了改善療效及提高預后的生存率，盡管人們不斷探索喉癌發(fā)生、發(fā)展機制，但喉癌發(fā)生的分子機制尚不明確。
　　microRNA(miRNA)是一類存在于生物體內非編碼單鏈小分子RNA，長度約

2、為21～25個核苷酸，它們通過堿基互補配對方式與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'UTR)完全或不完全結合，導致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，從而調控靶基因的表達。目前研究認為，miRNA通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式的作用對細胞生長、凋亡和細胞周期調控，導致腫瘤發(fā)生發(fā)展。我們前期通過miRNA芯片技術篩選到了一系列在喉癌中表達差異的miRNA，如：miR-106b、miR-151-3p、

3、miR-19b、miR-185、miR-139-5p等。后期我們通過熒光定量PCR進一步研究發(fā)現miR-106b在喉癌中顯著性表達，因此，本研究以miR-106b為研究對象，揭示其在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　第一部分miR-106b在喉癌組織中的表達研究
　　目的
　　研究miR-106b在喉癌、癌旁組織中表達水平。
　　方法
　　提取14例配對喉癌手術新鮮標本(喉癌組織和癌旁組織)RNA，用莖環(huán)實時熒光

4、定量PCR法檢測miR-106b在喉癌和癌旁組織中表達水平。
　　結果
　　喉癌組織中miR-106b表達水平較癌旁組織顯著增高。
　　結論
　　miR-106b在喉癌組織中高表達，推測miR-106b可能與喉癌發(fā)生發(fā)展有關。
　　第二部分miR．106b對喉癌細胞增殖、侵襲和體內生長能力的影響
　　目的
　　研究miR-106b對喉癌細胞體外增殖、侵襲和體內生長能力的影響。
　　方法

5、r>　　采用實時熒光定量PCR檢測轉染miR-106bASO后，Hep-2和TU-212喉癌細胞miR-106b表達水平，采用體外克隆形成實驗、細胞侵襲實驗和體內生長實驗觀察miR-106b對Hep-2和TU-212喉癌細胞增殖和侵襲能力影響。
　　結果
　　轉染了miR-106bASO的Hep-2和TU-212喉癌細胞其miR-106b表達水平降低了約80％，抑制miR-106b表達可以降低喉癌細胞體內外生長和體外侵襲能力

6、。
　　結論
　　miR-106b在喉癌細胞株中高表達，而抑制其表達可以部分逆轉喉癌細胞體內外生長和體外侵襲能力。
　　第三部分miR-106b靶向調控RUNX3的研究
　　目的
　　研究miR-106b是否可以直接靶向調控RUNX3。
　　方法
　　生物信息學方法篩選RUNX3的候選miRNA，熒光素酶報告基因實驗檢測候選miRNA對RUNX3的調控作用，Westernblot檢測轉染了miR

7、-106b模擬劑和抑制劑的喉癌細胞中RUNX3蛋白表達變化，采用熒光素酶報告基因實驗驗證miR-106b對RUNX3直接調控作用。
　　結果
　　預測的RUNX3上游的11個可能調控性miRNA，熒光素酶報告基因實驗顯示共轉染miR-130b、miR-106bmimics和RUNX3-3'UTR能夠顯著降低報告質粒熒光素酶的活性，其中miR-130b能夠直接靶定RUNX3在胃癌細胞中已有報導。因此，我們進一步研究miR-10

8、6b的作用。轉染miR-106bASO的喉癌細胞中RUNX3蛋白表達水平升高2～3倍，轉染miR-106bmimics的喉癌細胞中RUNX3蛋白表達水平降低約40%～70%。熒光素酶報告基因實驗顯示miR-106b功能被ASO減弱后，含有野生型RUNX3-3'UTR報告質粒熒光素酶活性顯著增強，轉染miR-106bmimics后，報告質粒熒光素酶活性顯著降低，而miR-106bmimics和miR-106bASO對含有突變型RUNX3-

9、3'UTR的報告質粒的熒光素酶活性則無顯著影響。
　　結論
　　RUNX3為miR-106b的靶基因。
　　第四部分喉癌中miR-106b靶向調控RUNX3作用機制研究
　　實驗一喉癌中RUNX3基因啟動子甲基化及其蛋白表達的研究
　　目的
　　研究RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)及其蛋白表達與喉癌發(fā)生發(fā)展的關系。
　　方法
　　采用Westernblot檢測RUNX3在喉癌組織中的表達水平

10、。用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測RUNX3基因啟動子甲基化發(fā)生狀況。用WesternBlot檢測RUNX3蛋白在RUNX3啟動子甲基化喉癌組織、RUNX3啟動子非甲基化喉癌組織和正常喉上皮中的表達情況。免疫組化檢測正常喉上皮組織、癌旁組織、RUNX3啟動子甲基化喉癌組織和RUNX3啟動子非甲基化喉癌組織中RUNX3的表達情況。
　　結果
　　RUNX3啟動子甲基化發(fā)生率約為41.67%，無論RUNX3啟動子是否發(fā)生甲

11、基化，RUNX3在喉癌組織中均低表達。
　　結論
　　除RUNX3基因啟動子甲基化在喉癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用外，可能還有其它機制如miR-106b的調控引起喉癌的發(fā)生發(fā)展。
　　實驗二研究RUNX3在喉癌細胞中的作用
　　目的
　　過表達RUNX3，研究RUNX3在喉癌細胞中的作用
　　方法
　　構建過表達RUNX3的pCMV6/RUNX3，Westernblot檢測pCMV6/RUNX3質粒轉

12、染Hep-2和TU-212喉癌細胞后RUNX3蛋白表達水平，MTT實驗、克隆形成實驗和Transwell侵襲實驗觀察pCMV6/RUNX3質粒轉染細胞后生長曲線、增殖和侵襲能力變化。
　　結果
　　過表達RUNX3后，喉癌細胞生長侵襲能力明顯下降。
　　結論
　　上調RUNX3表達可以抑制喉癌細胞的生長、增殖和侵襲能力。
　　實驗三miR-106b靶向調控RUNX3在喉癌細胞中作用機制
　　目的

13、>　　研究miR-106b通過靶向調控RUNX3對喉癌細胞功能的影響。
　　方法
　　向喉癌細胞株中同時轉染RUNX3-siRNA和ASO-miR-106b，使得miR-106b和RUNX3的表達同時下調，WesternBlot檢測RUNX3表達水平，實時熒光定量PCR法檢測miR-106b表達水平，克隆形成實驗和Transwell侵襲實驗檢測細胞增殖和侵襲能力變化。
　　結果
　　喉癌細胞轉染ASO-miR-1