熱應(yīng)激對體外培養(yǎng)人黑素細(xì)胞生長及黑素合成的影響.pdf

1、目的:
　　人類皮膚的顏色主要靠表皮中黑素細(xì)胞（MC）合成黑素以及黑素傳遞至周圍角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）來維持。如果黑素細(xì)胞合成和傳遞黑素的功能出現(xiàn)異常，就會導(dǎo)致各種皮膚色素性疾病（如：白癜風(fēng)、黃褐斑等）的發(fā)生。因此研究影響黑素細(xì)胞合成和傳遞黑素的因素及其機制，對于預(yù)防和治療色素性皮膚病具有十分重要的臨床意義。
　　皮膚暴露于日光下可引起皮膚曬黑，既往的研究認(rèn)為這些改變主要與紫外線（ultraviolet,UV）,尤其是中波紫外

2、線（ultraviolet B,UVB）有關(guān)。但近來，越來越多的證據(jù)表明日光中主要的能量物質(zhì)—熱（紅外線）對皮膚具有類似UV的作用，同時熱（紅外線）還可增加皮膚細(xì)胞對UV的耐受性。上個世紀(jì)末，Nakazawa等首先比較了人表皮MC對兩種外源性刺激UVB和熱的細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：熱（42℃,60min）和UVB（20mJ/cm2）輻射處理純化培養(yǎng)的人表皮MC3d后，MC樹突增多延長、包體增大，細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑素合成增加、增值率下降。

3、同時還發(fā)現(xiàn)熱和UVB均能促進KC-MC共培養(yǎng)體系和組織工程皮膚中有功能的活性MC數(shù)量增加，所以作者認(rèn)為熱與UVB具有類似的MC生理調(diào)節(jié)作用。但后來Kim等人報道了一個相反的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)熱以溫度依賴方式分別減少了小鼠MC系Mel-Ab和人表皮MC的黑素合成。
　　為了進一步明確熱對黑素細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)作用，本實驗利用體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細(xì)胞研究了熱應(yīng)激對黑素細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞形態(tài)、黑素合成及酪氨酸酶活性的影響，并初步從蛋白層

4、面上探討了熱休克蛋白72（HSP72）和p53在熱應(yīng)激引起黑素細(xì)胞功能變化中的作用。
　　方法:
　　1.無菌操作獲取正常人包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，按照皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)法獲取黑素細(xì)胞；利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)為主要有絲分裂原建立正常人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)系，采用Masson-Fontana染色法對培養(yǎng)細(xì)胞進行鑒定，確定細(xì)胞種系。
　　2.采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定不同溫度(39℃、41℃、42℃、43

5、℃、45℃)的熱應(yīng)激對黑素細(xì)胞活力的影響并選擇最佳的溫度劑量作為實驗條件進行后續(xù)實驗。
　　3.比較正常溫度（37℃）與最佳實驗溫度熱應(yīng)激下的黑素細(xì)胞形態(tài)、酪氨酸酶活性和黑素含量的變化；并利用Western-bloting和RT-PCR技術(shù)比較正常溫度和熱應(yīng)激條件下黑素細(xì)胞中HSP72和p53的蛋白和基因表達(dá)水平的變化。
　　4.所獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。
　　結(jié)果:
　　1.黑素細(xì)胞在

6、熱應(yīng)激干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)較干預(yù)前胞體增大，樹突明顯增多、變短呈多極化，樹突上明顯可見樹枝狀分叉，電子顯微鏡顯示：實驗組細(xì)胞胞漿中黑素小體數(shù)量較對照組有所增加，黑素小體中黑素更加致密。實驗組與對照組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)均較完整，未見明顯的細(xì)胞器破壞。
　　2.體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞（MC）在42℃每天干預(yù)1h,連續(xù)干預(yù)3d的熱應(yīng)激條件下，細(xì)胞的黑素合成量為0.152±0.005，較正常對照組（0.086±0.005）有明顯增加，增長率為78

7、％（t=24.81，P<0.01）；相同條件下實驗組細(xì)胞的酪氨酸酶活性為0.193±0.004，較正常對照組（0.142±0.011）亦有明顯增加，增長率為36.4％（t=9.34，P<0.01）。
　　3.體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞（MC）在42℃每天干預(yù)1h,連續(xù)干預(yù)3d的熱應(yīng)激條件下，細(xì)胞在末次干預(yù)后6h、12h和24h的HSP72和p53的蛋白表達(dá)均高于對照組，末次干預(yù)后12小時的HSP72和p53的基因表達(dá)也均高于對照組。

8、
　　結(jié)論:
　　本次實驗結(jié)果顯示：42℃的熱應(yīng)激條件下，體外培養(yǎng)的正常人MC的細(xì)胞狀態(tài)明顯好于正常對照組，并且其細(xì)胞的各項生物學(xué)活性較正常對照組亦明顯增強，這表明熱應(yīng)激對體外培養(yǎng)的正常人MC生物功能起著一定的正向調(diào)節(jié)作用。HSP72和p53蛋白在熱應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)較正常對照組升高，提示我們這兩種蛋白分子可能在熱應(yīng)激引起MC生物活性增強的過程中起著重要的調(diào)控作用。這為進一步研究熱應(yīng)激調(diào)節(jié)人表皮MC生長和黑素合成的作用機制提供了