顱腦損傷后代謝型谷氨酸受體1a（mGluR1a）表達(dá)及競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑1-氨基茚-1，5-二羧酸（AIDA）作用研究.pdf

1、顱腦損傷是神經(jīng)外科常見(jiàn)疾病之一,其發(fā)病率及致死、致殘率均較高,是危害身心健康的主要疾病之一.急性腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元損傷可分為兩種形式,一種稱(chēng)為原發(fā)性神經(jīng)元損傷,是損傷暴力對(duì)神經(jīng)元的機(jī)械損傷,在創(chuàng)傷的同時(shí)發(fā)生;另一種稱(chēng)為遲發(fā)性神經(jīng)元損傷,主要表現(xiàn)為興奮性毒性死亡和凋亡兩種形式,由多種因素引起,在創(chuàng)傷后幾小時(shí)、幾天甚至更長(zhǎng)時(shí)間后發(fā)生.谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一,顱腦損傷可引起Glu的過(guò)量釋放,激活Glu受體.Glu通

2、過(guò)離子型谷氨酸受體(iGluRs)和代謝性谷氨酸受體(mGluRs)作用于神經(jīng)元.但目前的研究主要集中在iGluRs,而關(guān)于m GluRs在腦損傷病理生理中的作用卻知之甚少.代謝型谷氨酸受體是一類(lèi)與G蛋白耦聯(lián)的調(diào)節(jié)離子通道和第二信使生成酶的特異受體,存在的多種亞型反映出它們?cè)诠δ苌系亩鄻有院蛷?fù)雜性,不同亞型的受體具有不同的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.它們對(duì)谷氨酸介導(dǎo)的突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用可以表現(xiàn)為增強(qiáng)作用,也可以表現(xiàn)為抑制效應(yīng),最終效應(yīng)取決于局部神

3、經(jīng)環(huán)路的構(gòu)成.依據(jù)mGluRs序列同源性信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和藥理學(xué)敏感性將該受體分為3組共8種亞型,第Ⅰ組包括mGluRl(mGluRla、b、c、d、e)和mGluR5(mGlu.R5a和b),與Gq蛋白偶聯(lián);第Ⅱ組受體包括mGluR2和mGluR3,與Gi蛋白偶聯(lián);第Ⅲ組谷氨酸受體包括mGluR4(mGluR4a和4b),mGluR6,.mGluR7(mGluR7a和7b)和mGluR8(:mGluR8a和8b),與Gi蛋白偶聯(lián).一系列研

4、究顯示,大鼠彌漫性腦損傷后腦皮層內(nèi)3組mGluRs表達(dá)均有改變但以mGluRl變化最為顯著,是加重神經(jīng)元損傷的主導(dǎo)因素.mGluRl激活后通過(guò)使PLC活化,促使磷脂酰肌醇(PI)水解為三磷酸肌醇(IP3)與二?；视?DAG),二者均為胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使. 多年來(lái)學(xué)者們致力于顱腦損傷生理病理機(jī)制、實(shí)驗(yàn)性治療的研究,建立了多種在體及體外顱腦損傷模型.由于體外研究模型能夠排除體內(nèi)損傷過(guò)程中一些復(fù)雜因素的影響,并具有能夠選擇性的

5、觀察單因素對(duì)某種類(lèi)型細(xì)胞的影響的優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)日益受到研究者的重視.在本實(shí)驗(yàn)中我們建立了一種新的體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機(jī)械損傷模型,并在該模型的基礎(chǔ)上探討損傷前后mGluRla的表達(dá)及其拮抗劑AIAD的作用和意義.此外,我們?cè)谧杂陕潴w損傷模型的基礎(chǔ)上探討傷后不同時(shí)間大鼠大腦皮層m GIuRla表達(dá)的變化及其拮抗劑AIAD的作用和意義.實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分: 第一部分:體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型的建立 目的:介紹一種

6、較為簡(jiǎn)單的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法并在此基礎(chǔ)上建立體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型. 方法:出生24小時(shí)以內(nèi)的SD大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng),針頭機(jī)械性劃傷培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元,依劃傷程度不同分為輕度和重度損傷2組,對(duì)照組除不進(jìn)行劃傷處理外,其余處理同損傷組.傷后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)皮層神經(jīng)元存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量. 結(jié)論:體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性好,能模擬顱腦損傷后神經(jīng)元損傷過(guò)程,可控制

7、損傷程度;是一種較好的體外神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型. 第二部分:皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷后mGluRla的表達(dá)規(guī)律及其競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑AIDA的保護(hù)作用 目的: 研究體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷后mGluRla的表達(dá)規(guī)律及其競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑AIDA的保護(hù)作用. 方法:出生24小時(shí)以內(nèi)的SD大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7天,隨機(jī)分為創(chuàng)傷組和AIDA組;以針頭造成細(xì)胞機(jī)械性損傷,AIDA處理組在損傷前30分鐘每孔加入AIDA20μm

8、ol;RT-PCR和Western blotting 法檢測(cè)損傷前后體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元mGluRla的表達(dá);傷后不同時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)元免疫組化染色;傷后不同時(shí)間點(diǎn)留取創(chuàng)傷組及治療組培養(yǎng)液上清檢測(cè)LDH含量;采用Fura-2/AM雙波長(zhǎng)熒光法測(cè)定損傷前后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度變化,同時(shí)測(cè)定接受AIDA治療的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度. 結(jié)論: 體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷后mGluRla表達(dá)明顯增強(qiáng),創(chuàng)傷引起

9、的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度升高可被mGluRsla拮抗劑AIDA阻斷,AIDA有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用. 第三部分:急性彌漫性腦損傷后神經(jīng)元mGluRla的表達(dá)規(guī)律及其競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑AIDA的保護(hù)作用 目的:研究大鼠急性腦損傷后大腦皮層mGluRla的基因表達(dá)變化與其拮抗劑AIDA的作用. 方法:SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純損傷組、生理鹽水治療組(NS)和AIDA治療組共4組,參照Marmarou自由落體方

10、法制作彌漫性腦損傷(DBI)模型,治療組大鼠在損傷前30分鐘經(jīng)側(cè)腦室注射生理鹽水或AIDA溶液10μ1;假手術(shù)組和單純打擊組大鼠在傷后不同時(shí)間斷頭取腦進(jìn)行RT-PCR、HE染色、腦組織含水量測(cè)定和免疫組化研究;治療組大鼠傷后不同時(shí)間斷頭取腦進(jìn)行腦組織含水量測(cè)定和免疫組化研究,在傷后1天、1周及2周進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(NSS). 結(jié)論: mGluRla參與腦外傷后的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷,其競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑AIDA可改善損傷大鼠預(yù)后,對(duì)急