芍藥苷對缺氧損傷人臍靜脈內皮細胞的影響.pdf

1、目的：血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VEC)作為組織與血液間的第一道屏障，是最先感受缺氧的細胞之一。在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程中，內皮細胞受損、功能障礙是其中的關鍵因素。芍藥苷(paeoniflorin，Pae)是從赤芍中提取的生物活性成分，是一種蒎烷單萜苷，文獻報道有抗心肌缺血的作用。為了深入探討芍藥苷保護心肌缺血損傷的作用機制，本研究在成功培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical

2、vein endothelial cells，HUVEC)的基礎上，建立穩(wěn)定可靠的體外細胞缺氧模型，模擬心肌缺血缺氧微環(huán)境，探討HUVEC在缺氧條件下細胞中SOD活性和MDA含量的變化，細胞培養(yǎng)上清中LDH活性和NO含量的變化，內皮細胞中eNOS、粘附分子以及NF-кB表達的變化，同時觀察Pae的干預作用，希冀揭示Pae抗心肌缺血的可能作用機制。 方法：采用膠原酶灌注法原代提取HUVEC，根據鏡下內皮細胞的形態(tài)學特征及免疫熒光法

3、檢測細胞內von willebrand factor (vWF)，確定分離的細胞為內皮細胞來源，細胞傳至3～5代時進行實驗。采用法國BioMérieuxRsa公司缺氧裝置系統(tǒng)，建立HUVEC缺氧模型。MTT法檢測Pae對缺氧損傷的HUVEC活性的影響，利用試劑盒檢測Pae對缺氧損傷的HUVEC細胞中SOD活性和MDA含量以及細胞培養(yǎng)上清中LDH活性，觀察Pae對缺氧損傷的HUVEC細胞是否具有保護作用。分別利用硝酸還原酶法及免疫細胞化學

4、法檢測細胞培養(yǎng)上清中一氧化氮的含量及eNOS的活性，用細胞ELISA法分析Pae對缺氧損傷HUVEC表達粘附分子ICAM-1，VCAM-1的影響，免疫細胞化學法檢測Pae對缺氧損傷HUVEC細胞中NF-κB的影響，進而分析Pae保護缺氧損傷的HUVEC的機制。 結果：1.培養(yǎng)的細胞倒置顯微鏡下觀察表現為典型的鋪路石樣形態(tài)學特征，融合后呈現單層生長和接觸抑制的特性；免疫熒光法檢測到95﹪以上的細胞胞漿內有vWF的表達，表明所分離的

5、細胞為內皮細胞來源。2.MTT結果表明Pae能抑制缺氧引起的HUVEC減少，且呈現一定的濃度依賴性。3.芍藥苷可以使缺氧損傷的內皮細胞中SOD活性明顯升高而MDA含量明顯降低，使細胞培養(yǎng)液中LDH活性降低。4.缺氧可導致HUVEC產生的NO明顯減少，降低eNOS的表達。Pae能使缺氧損傷的HUVEC產生的NO增加，并有劑量依賴性，Pae各劑量組均能增加eNOS的表達。5.缺氧能顯著增加HUVEC表達ICAM-1，VCAM-。Pae能抑制

6、缺氧損傷的HUVECICAM-1及VCAM-1的表達升高。且呈現一定的濃度依賴性。6.缺氧可誘導HUVEC顯著表達NF-κB，Pae各劑量組均能明顯降低NF-κB的表達。 結論：1.應用膠原酶灌注消化法分離HUVEC，并用免疫熒光法對所分離的細胞進行了鑒定，證實為內皮細胞，為后續(xù)的試驗提供了細胞來源。 2.建立了HUVEC缺氧模型，模擬體內心肌缺血、缺氧的微環(huán)境，為抗心肌缺血藥物體外機理研究提供了穩(wěn)定可靠的細胞模型。