應用膜片鉗技術(shù)對人食管下括約肌鈣離子通道的研究.pdf

1、目的：醫(yī)學界對食管下括約肌(lower esophagealsphincter,LES)是否存在及其結(jié)構(gòu)特點的探討經(jīng)歷了一個很長的發(fā)展過程。直到1979年，Liebermann-Meffert等學者通過對32例尸體標本的解剖研究，詳細闡述了食管胃連接部(esophagogastric junction，EGJ)平滑肌束的宏觀排列，提出人類LES的肌肉系統(tǒng)由套索纖維(sling fibers)和鉤狀纖維(claspfibers)共同構(gòu)成。

2、鉤狀纖維位于LES右側(cè)，呈半環(huán)形，套索纖維是一組不完整的U形肌束懸掛于胃食管交界部，食管下端的左側(cè)，His角上方。它的開口側(cè)位于胃小彎，閉口側(cè)位于胃大彎。這兩束肌肉共同維持LES的關(guān)閉狀態(tài)，并形成了LES高壓帶(high-pressure zone，HPZ，1 5-30mmHg)。這一理論為進一步研究LES的生理、病理和藥理學特性奠定了基礎(chǔ)。隨后學者們主要對不同動物LES的生理學特點和功能調(diào)節(jié)進行了較為深入的探討，發(fā)現(xiàn)LES具有明顯不同

3、于其它平滑肌結(jié)構(gòu)的特性。而且更為重要的是，構(gòu)成LES的套索纖維和鉤狀纖維在諸多方面也存在著很大的差異性。因此，LES結(jié)構(gòu)或功能狀態(tài)的異常是多種食管疾病的病理基礎(chǔ)。 現(xiàn)在一般認為，平滑肌細胞胞漿游離Ca2+在平滑肌收縮過程中起重要的“第二信使”作用。平滑肌細胞的收縮活動依賴胞漿中Ca2+的濃度，高濃度Ca2+引起平滑肌收縮，低濃度Ca2+引起平滑肌舒張。平滑肌收縮時的Ca2+來源于細胞外液Ca2+內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放(主要

4、是肌質(zhì)網(wǎng)，SR)。胞外Ca2+可通過質(zhì)膜鈣離子通道進入細胞；胞內(nèi)Ca2+的釋放也通過鈣離子通道。鈣離子通道存在于所有可興奮細胞以及一些非興奮細胞乃至原核生物。同骨骼肌、心肌類似，鈣通道對內(nèi)臟平滑肌細胞的舒縮起著舉足輕重的作用。而平滑肌細胞膜L型鈣通道在平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)中起重要作用，當平滑肌細胞膜去極化時，通過L型鈣通道流入細胞內(nèi)的Ca2+是平滑肌細胞收縮的觸發(fā)因素。本研究應用細胞膜片鉗技術(shù)(patch clamp technique

5、)對人類LES平滑肌細胞膜上鈣離子通道的類型及常見的影響因素進行分析，并深入探討構(gòu)成LES的套索纖維和鉤狀纖維可能具有的不同生物學特征及其內(nèi)在機制?？梢栽O(shè)想，對LES的深入研究將大大有助于對賁門失弛癥、食管下括約肌高壓癥等食管運動功能障礙性疾病，以及胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)等食管良性疾病病因和病理學的理解以及治療方法的選擇。 方法：選取2007年1月至2007年12

6、月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因食管中段癌行食管大部切除術(shù)患者22例，其中男性13例，女性9例，平均年齡57.3歲。手術(shù)室采集新鮮手術(shù)標本，銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后，制備套索纖維、鉤狀纖維的肌條，將肌條剪成2mm3的小塊，用含膠原酶Ⅱ和木瓜酶的細胞分離液分離出單個平滑肌細胞。確認分離細胞活性在95％以上。然后用37℃Hepes緩沖液懸浮備用。 細胞存活率測定：取5滴細胞懸浮液，加1滴0.2％的臺盼藍溶液，混勻3

7、min內(nèi)計數(shù)，當細胞死亡時將被染成紅色，活細胞無色。用以下公式計算細胞存活率：存活率(％)=活性細胞總數(shù)P/(活性細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100％。將細胞灌流槽固定于倒置顯微鏡的工作臺上，吸取急性分離的平滑肌細胞懸液數(shù)滴于灌流槽中，待細胞貼壁后，用鈣電流相應的灌流液灌流，選取表面光潔、邊緣整齊，光滑的，靜止不動，立體感強的細胞為研究對象。記錄電極由硬質(zhì)玻璃毛坯經(jīng)水平拉制儀(Sutter P-97，USA)四步拉制而成，內(nèi)充鈣離子電極內(nèi)液后阻

8、抗為2～3M Ω。采用三維液壓微操縱器將電極靠近細胞進行封接，負壓吸引致封接阻抗達1GΩ以上，吸破細胞膜，補償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細胞記錄模式。脈沖信號由pulse+pulsefit軟件(HEKA，version 8.53，法耳次，德國)控制，通道信號經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器(HEKA，法耳次，德國)放大，通過Ag-AgC1電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導入細胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC-9轉(zhuǎn)換，為pulse+pulsefit軟件

9、收集、分析，收集到的數(shù)據(jù)采用Origin 7.5擬合。所有實驗在室溫(25℃)下進行。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x-)±s)表示，兩組均數(shù)的比較用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，通過軟件SPSS 13.0(SPSS公司，芝加哥，美國)完成。以P＜0.05為差異在統(tǒng)計學上有顯著性意義。 結(jié)果：1 單個LES細胞的形狀在倒置顯微鏡下，新鮮分離的食管下括約肌套索纖維及鉤狀纖維平滑肌細胞呈梭形，長短不一。在Hepes緩沖液中，部分平滑肌細胞完全舒

10、張，部分處于不同程度的收縮狀態(tài)，二者均有一個中心核(Fig.2～3)。套索纖維細胞平均長度為101.1±27.2μm(51～148μm，n=200)；鉤狀纖維平滑肌細胞長度為99.5±23.6μm(48～146μm，n=200)。二者比較無統(tǒng)計學意義P＞0.05(t=0.247，P=0.676)。 2 I-V曲線將細胞鉗制在-60mV或-90mV，以10mV的階躍刺激細胞去極化從-80～+30mV，波寬為200ms?？捎涗浀揭粌?nèi)向電流，

11、在刺激開始后5～13ms時出現(xiàn)，在I-V曲線中0mV達到峰值，在約-50mV處翻轉(zhuǎn)。兩者的IV曲線均呈U型，只不過峰值不同，在鉗制電位為-60mV時為-5.58±1.53pA/Pf(n=6 cells)，顯著低于鉗制電位為-90mV的內(nèi)向電流-7.02±0.93pA/pF(n=6cells)，P＜0.05(t=1.970，P=0.043)。并且套索纖維及鉤狀纖維平滑肌細胞的記錄電流未發(fā)現(xiàn)不同。 3.Nifedipine對內(nèi)向電流

12、的影響Nifedipine可顯著抑制內(nèi)向電流，鉗制電壓為-60mV和-90mV時，10μm Nifedipine幾乎可完全取消內(nèi)向電流(-0.44±0.73pA/pF&-1.47±1.23 pA/pF，n=6 cells)。和正常電流相比P＜0.05(t=7.427，P=0.000&t=8.816，P=0.000)。在0.1、1、5μm時也發(fā)現(xiàn)相同的趨勢。 結(jié)論：1.套索纖維和鉤狀纖維肌細胞形態(tài)類似，長度相當。 2.人L