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文檔簡介
1、目的:臨床上約5%~10%慢性肝病患者依據(jù)臨床表現(xiàn)、生化及血清學檢查仍不能明確病因,其中一部分忠者通過肝穿刺活檢和(或)血清HBVDAN檢測,確診為隱匿性HBV感染(OccultHepatitisBvirusinfection)。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū),對隱匿性乙型肝炎應(yīng)引起重視。為此,本課題研究一組不明原因性肝炎患者隱匿性HBV感染情況并從基因變異角度研究HBV隱匿性感染的分子機制。 方法:(1)病歷選擇和血清收集:不明原因性
2、肝炎患者104例,收集臨床資料并清晨空腹靜脈采血。(2)模板制備:分別用直接煮沸法、辛酸鈉法、蛋白酶K消化-酚-氯仿法、PEG8000法、辛酸鈉-酚-氯仿法、堿裂解法、柱抽提法,抽提血清中HBVDNA,比較各抽提方法的目的基因得率、靈敏度及重復性。尋找適合于HBV隱匿性感染模板制備方法。(3)引物設(shè)計:HBV基因組不同區(qū)段分別設(shè)計2套巢式引物,比較擴增效率,選擇擴增效率高的引物。(4)巢式PCR擴增,查出隱匿性HBV感染者。(5)HBV
3、S、X區(qū)擴增產(chǎn)物測序和變異位點分析,發(fā)現(xiàn)可能和HBV隱匿性感染有關(guān)的變異位點。 結(jié)果:(1)在7種不同的抽提方法中,辛酸鈉-酚-氯仿法在目的基因得率、靈敏度、重復性方面均優(yōu)于其它方法。(2)104例不明原因性肝炎患者中查出隱匿性HBV感染13例。(3)S基因區(qū)未發(fā)現(xiàn)有義突變,X基因區(qū)及重疊核心啟動子區(qū)、增強子Ⅱ區(qū)發(fā)現(xiàn)多位點變異,可能與HBV隱匿性感染有關(guān)。 結(jié)論:辛酸鈉-酚-氯仿法在隱匿性HBV感染DNA檢測中有較好的效
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