靶向c-fos與junB RNAi表達載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、本論文研究內(nèi)容分為兩個部分。
　　 第一部分：藥物成癮性是由于長期藥物濫用導(dǎo)致的一種復(fù)雜的大腦疾病，現(xiàn)已成為全世界關(guān)心的社會和醫(yī)學(xué)問題，其主要特征是一旦成癮，將經(jīng)久不衰，很難消失。關(guān)于藥物的精神依賴至今尚無理想的根治方法，本研究根據(jù)即刻早期基因c-fos，junB與藥物成癮的密切關(guān)系，深入探討c-fos與junB基因?qū)λ幬锍砂a作用的影響，進而尋求解決藥物精神依賴的有效基因療法。
　　 本實驗主要采用RNAi技術(shù)，應(yīng)用RN

2、A聚合酶Ⅲ中的U6啟動子成功構(gòu)建了靶向c-fos與junB基因的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pKB-GU-shC，pKB-GU-shB以及陰性對照載體pKB-GU。采用Exgen500轉(zhuǎn)染試劑法將各重組干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至PC12細胞，考察細胞接種數(shù)目，細胞融合度，N/P及血清等因素優(yōu)化得到最佳瞬時轉(zhuǎn)染效率為50％左右。進一步將載體瞬時轉(zhuǎn)染至大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC-12細胞，通過RT-PCR實驗檢測c-fos與junB基因的表達情況；同時我們對轉(zhuǎn)染單基

3、因沉默載體的PC12細胞在G418抗性篩選壓力下進行穩(wěn)定篩選，2周左右得到穩(wěn)定表達細胞株，對其進行了RT-PCR實驗。結(jié)果表明，與陰性對照組相比，瞬時轉(zhuǎn)染PC12細胞中c-fos與junB的mRNA相對表達量與無干擾質(zhì)粒pKB-GU組無明顯差別。穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒pKB-GU-shC，pKB-GU-shB的PC12細胞中c-fos與junB的mRNA相對表達量分別為51％和49.73％。
　　 本研究通過基因重組技術(shù)，分別成功構(gòu)建

4、了靶向c-fos與junBRNAi載體并成功篩選出不同干擾質(zhì)粒的抗性克?。煌ㄟ^RT-PCR技術(shù)，檢測出上述干擾序列可以有效地抑制PC12細胞c-fos與junB的表達，為進一步在整體水平中研究c-fos及junB基因的功能提供了新的研究方法，在某種程度上為藥物成癮的分子機制研究提供了一個較好的體外細胞模型。
　　 第二部分：腫瘤的發(fā)病機制涉及到多個信號通路，它們相互聯(lián)系、相互作用，組成一個分子網(wǎng)絡(luò)體系，因此針對單個靶點進行抗腫瘤

5、治療很有可能收效甚微。為了說明腫瘤多靶點治療的重要意義，將同時靶向hEGFR和hTERT不同序列的16個pRS-G-T系列的雙基因RNA干擾表達載體以及分別靶向hEGFR，hTERT的8個單基因RNA干擾載體及陰性對照質(zhì)粒pRS采用Exgen500轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細胞SMMC-7721，MTT檢測細胞增殖抑制率，結(jié)果顯示雙基因RNAi載體pRS-shG4-T4和pRS-shG3-T4對肝癌細胞的抑制率均可達到40％左右。將對肝癌細胞

6、SMMC-7721生長抑制效率最好的重組載體pRS-G4-T4，pRS-G3-T4以及在單基因RNAi中篩選出抑制基因表達效果最好的shRNA，組成的雙基因載體pRS-G2-T2分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，48h后RT-PCR檢測到細胞中的hEGFRmRNA相對表達量分別為0.9，0.843，0.538；hTERTmRNA的相對表達量分別為0.679，0.74，0.32。腫瘤的發(fā)病是一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)疾病，為了進一步揭示腫瘤發(fā)病機制