慢病毒介導的Nanog基因對周圍神經損傷性神經病理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響.pdf

1、研究背景及目的：神經病理性疼痛（Neuropathic Pain，NPP）是外周或中樞軀體感覺神經系統(tǒng)損傷或病變引起的一種頑固性疼痛綜合征，以自發(fā)性疼痛（Spontaneous pain）、痛覺過敏（Hyperalgesia）和觸摸痛（Allodynia）為特點。NPP的發(fā)病機制仍未闡明，治療效果不佳，是目前研究的熱點。目前國內外研究普遍認為抑制核因子-κB（NF-κB）的激活可以緩解動物的機械性感覺異常和熱痛覺過敏，因此抑制NF-κB

2、的激活是一個有潛力的NPP治療策略。此外，在胚胎干細胞的自我更新與分化機制研究中，有學者發(fā)現(xiàn)Nanog通過與NF-κB家族各蛋白相結合抑制它們的轉錄活性和促分化能力，從而維持胚胎干細胞的多能性。用Nanog來抑制NF-κB的活性可能是一個有效的治療NF-κB過度激活所引起的神經系統(tǒng)疾病的方法。我們前期的實驗研究已發(fā)現(xiàn)轉Nanog基因的骨髓間充質干細胞（BMSCs）的NF-κB表達明顯減弱。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上

3、，從而達到持久性表達，起到良好的基因治療效果，具有廣闊的應用前景。為探討Nanog基因對周圍神經損傷性NPP的治療機制和效果，我們構建Nanog基因慢病毒載體質粒，進行慢病毒的包裝、濃縮、滴度測定和鑒定，接著通過體外實驗研究Nanog基因對脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應的影響，最后進行體內實驗觀察Nanog基因對大鼠周圍神經損傷性神經病理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 攜帶Nanog基因

4、慢病毒重組載體質粒（pNL-Nanog-IRES2-EGFP）的構建及鑒定
　　材料與方法：雙酶切（NheI/BamHI）克隆質粒pUC57-Nanog和慢病毒載體質粒pNL-IRES2-EGFP，膠回收目的基因片段。T4連接酶連接回收的目的片段。轉化DH5α大腸桿菌后涂于含抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板37℃12-16小時。挑選菌落進行PCR鑒定。鑒定正確的菌落搖菌后進行質粒的小量提取，最后雙酶切和測序鑒定。
　　結果：經雙酶

5、切和測序鑒定pNL-Nanog-IRES2-EGFP重組質粒構建正確。
　　結論：成功構建大鼠Nanog基因慢病毒重組載體質粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP，為研究Nanog基因的功能奠定了基礎。
　　第二部分 攜帶Nanog基因慢病毒載體的包裝、濃縮、滴度測定和鑒定
　　材料與方法：將慢病毒載體質粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP、包裝質粒
　　pHELPER和包膜質粒pVSVG共轉染293T

6、細胞，包裝生產慢病毒。收集病毒懸液，離心取上清，0.45um濾器過濾，加入含聚乙二醇（PEG）的濃縮試劑，混勻后4℃過夜，離心取沉淀，PBS重懸后分裝，-80℃保存。倍比稀釋法測定慢病毒滴度。RT-PCR和Western Blot檢測NanogmRNA和蛋白質的表達水平。
　　結果：三質粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共轉染293T細胞后成功產生出了慢病毒。病毒原液經濃縮后的功能滴度為2×10

7、7TU/mL以上。RT-PCR和Western Blot檢測證實慢病毒感染的293T細胞中有NanogmRNA和蛋白質的表達。
　　結論：包裝生產出了高滴度攜帶Nanog基因的慢病毒，為進一步的體外體內實驗打下了基礎。
　　第三部分 脂質體介導的Nanog基因轉移抑制脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應的體外實驗研究
　　材料與方法：無菌條件下分離出生后2-3天Sprague-Dawley（SD）大鼠的大腦皮質，去除腦膜和血

8、管，切碎，胰酶消化，200目濾網過濾，制成細胞懸液后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8天后加入鹽酸利多卡因進行分離純化。取3-8代細胞進行體外刺激和干預實驗，分為正常對照組、LPS單獨刺激組、不同濃度pNL-Nanog-IRES2-EGFP轉染（1.0、2.0、3.0）后LPS刺激組。在不同的時間點用MTT檢測各組細胞的增值能力，RT-PCR檢測各組細胞β-actin、Nanog、IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平，ELISA檢測各組

9、細胞IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達水平。
　　結果：Nanog和LPS對小膠質細胞的生長狀態(tài)沒有明顯影響。Nanog可以降低LPS誘導的小膠質細胞IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表達水平。
　　結論：體外實驗證實Nanog可以阻止LPS誘導的小膠質細胞促炎癥因子的釋放，減弱細胞的炎癥反應，具有抗炎作用。
　　第四部分 慢病毒載體介導的Nanog基因轉移對大鼠周圍神經損傷性神經病理性疼痛模型

10、脊髓突觸重塑的影響
　　材料與方法：雄性SD大鼠40只，4-5月齡，體重180-200克，隨機分為5組即假手術組、雙側壓迫性坐骨神經損傷（bCCI）組、bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組和bCCI+LV-Nanog-EGFP組，每組8只。bCCI術后第1天，分別向bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組和bCCI+LV-Nanog-EGFP組大鼠L4-L6脊髓節(jié)段雙側分別直接注射2μL生理鹽水、LV-EGFP

11、和LV-Nanog-EGFP。術前及術后每隔3天進行機械痛閾、熱痛閾和冷痛閾的測定。術后第90天處死大鼠，取脊髓，制作切片。熒光顯微鏡下觀察脊髓背角綠熒光蛋白的表達情況，甲苯胺藍染色觀察神經元的數(shù)量，免疫組織化學染色觀察突觸素（Syn）、P65、Mu阿片受體（MOR）和膽囊收縮素8（CCK-8）的表達水平，體視學影像系統(tǒng)分析突觸數(shù)量的變化及其與神經元的比例。
　　結果：與假手術組相比bCCI組于術后第4天起機械痛閾值、熱痛閾值、冷

12、痛閾值開始下降，三者分別于術后第16、13、21天降至最低（P<0.05），機械痛閾值和熱痛閾值分別于45和33天回到基線，而冷痛閾值持續(xù)到術后第90天仍遠離基線。bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組與bCCI組相比痛閾無顯著改善（P>0.05）。bCCI+LV-Nanog-EGFP組與bCCI組相比痛閾顯著改善（P<0.05）。甲苯胺藍染色染色顯示各組脊髓背角神經元數(shù)量無明顯差異（P>0.05）。免疫組織化學染色顯示與假手

13、術組相比bCCI組、bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組Syn、P65表達明顯增加（P<0.05），MOR、CCK-8表達明顯下降（P<0.05）；bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組與bCCI組相比各指標無明顯差異（P>0.05）；bCCI+LV-Nanog-EGFP組與bCCI組相比各指標有顯著性差異（P<0.05）。體視學影像分析系統(tǒng)計數(shù)顯示突觸和神經元數(shù)量的比例bCCI組、bCCI+生理鹽水組、bCCI+

14、LV-EGFP組較假手術組顯著增加（P<0.01），bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組與bCCI組相比無明顯差異（P>0.05）；bCCI+LV-Nanog-EGFP組與bCCI組相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　結論：慢病毒介導的Nanog基因脊髓背角直接注射可以減少bCCI后脊髓背角Syn、P65的表達，增加MOR、CCK-8的表達，降低突觸和神經元數(shù)量的比例，提高疼痛閾值水平，具有治療神經病理性疼痛的作用