miR-200a及其甲基化在結直腸癌中的作用研究.pdf

1、研究背景:結直腸癌是我國最常見的、對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一。近年來，隨著人們生活水平的提高，生活習慣的改變，結直腸癌的發(fā)病率逐年上升。結直腸癌根治術治療效果顯著，但由于癌組織在早期已經發(fā)生侵襲和轉移，它仍然對患者的生命健康具有極大威脅。因此，探討結直腸癌發(fā)生及轉移的機制，仍是腫瘤學的迫切任務。
　　 甲基化是真核細胞中DNA正常的修飾方式。在正常發(fā)育的早期階段，甲基化和去甲基化的交替進行是細胞得以生長和分化的關鍵程序，在

2、保持細胞基因組穩(wěn)定性中甲基化也起著至關重要的作用。同時發(fā)現(xiàn)，在許多人類腫瘤中也有不同程度的DNA異常甲基化現(xiàn)象。啟動子區(qū)CpG島發(fā)生異常高甲基化可導致基因轉錄沉默，使抑癌基因、細胞周期調節(jié)基因、凋亡基因等表達極度降低或不表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在許多惡性腫瘤的癌前病變中發(fā)現(xiàn)了多個抑癌基因的CpG島高甲基化。這說明，啟動子區(qū)CpG島高甲基化在腫瘤的早期階段已存在。
　　 DNA甲基化轉移酶(DNMTs)是DNA甲基化發(fā)生、完成、

3、持續(xù)的重要作用酶。目前發(fā)現(xiàn)的DNA甲基化轉移酶主要有四種即DnmT1、DnmT2、DnmT3a、DnmT3b。研究表明，DNMT1主要作用是對新合成的DNA鏈進行甲基化修飾并維持，在乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均表達異常增高，并與腫瘤的分化程度、臨床分期或（和）預后不良有不同程度的相關性。DNMT1過表達會導致多種基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化。
　　 近年來微小RNA(microRNA，miRNA)逐漸被研究者重視，成為腫瘤研

4、究的熱點。miRNA是真核生物細胞中一類長度約為18-24核苷酸的內源性非編碼小分子RNA。它由DNA轉錄產生，但并不翻譯蛋白質，而是在蛋白質合成中起調節(jié)其他基因的功能，是調控其他蛋白質編碼基因的基因。它通過非特異性結合位點的作用，可以對多個基因經行一對多、多對一的調控作用。因此，對miRNA特別是成家族的miRNA的檢測較之單個基因的檢測，在腫瘤的煙酒及之中更具前瞻性意義。miR-200家族是近年來研究的熱點，miR-200a作為mi

5、R-200家族（包括miR-200a, miR-200b，miR-200c，miR-114，miR-429）的一員在多種腫瘤中表達下調，主要通過調控上皮-間質轉化(EMT)過程，對腫瘤的侵襲、轉移起關鍵作用。本課題組在前期的工作中對miR-200a在結直腸癌新鮮組織中的表達進行了小樣本量的檢測。檢測結果表明，miR-200a的表達與結直腸癌的分化程度具有相關性。在結直腸癌細胞中的檢測表明miR-200a可以調控細胞的EMT現(xiàn)象。在前期工

6、作的基礎上，為了深入了解miR-200a在結直腸癌侵襲轉移的分子機制，探尋miR-200家族啟動子區(qū)域甲基化與結直腸癌浸潤轉移之間的關系，擬進一步進行如下研究。
　　 研究內容:
　　 1.檢測HCT116、HT29、LS174t、SW480、SW620、Lovo這6株細胞中miR-200家族啟動子甲基化狀態(tài)，分析其與臨床分期、分化程度及預后的相關性;同時進行miR-200家族甲基化程度與患者生存相關與分析;
　　

7、 2.對HCT116、HT29細胞使用抑制miR-200a處理，對SW620、Lovo細胞使用過表達miR-200a處理，檢測miR-200a表達量改變對細胞運動轉移能力和DNMT1表達的影響;
　　 3.對HCT116、HT29細胞使用抑制miR-200a處理，激活TGF-β通路處理，對SW620、Lovo細胞使用過表達miR-200a處理，抑制ERK通路，通過免疫印跡方法檢測通路中標志物TβRⅡ、p-ERK表達量，探討mi

8、R-200a對DNMT1調控的作用機制。
　　 4.在HCT116、HT29、SW620和Lovo四株細胞中分別下調和上調miR-200a，檢測TGF-β1表達量，并通過生物信息學分析，尋找miR-200a與TGF-β通路可能存在的調控靶點。
　　 結果:
　　 1.BSP方法檢測結果顯示，六株不同惡性程度的結直腸癌細胞株中miR-200家族啟動子甲基化程度不同，并且其甲基化程度與細胞惡性程度成反比，與細胞株中m

9、iR-200a表達量的檢測結果一致。MSP方法檢測顯示，在138例結直腸癌組織中miR-200家族啟動子甲基化程度與患者年齡無關，與患者性別(F=6.834，P=0.033)、腫瘤最大直徑(F=11.310，P=0.003)、淋巴結及遠處轉移(F=23.929，P=0.000)及患者術后生存時間相關;完全甲基化病例三年生存率明顯低于未甲基化和部分甲基化病例(x2=8.967，P=0.01)，未甲基化和部分甲基化病例之間無明顯差異;完全甲

10、基化病例五年生存率明顯低于未甲基化和部分甲基化病例(x2=24.934，P=0.000)，部分甲基化病例低于未甲基化病例(x2=18.271，P=0.000)。
　　 2.對miR-200a高表達的HT29和HCT116細胞進行miR-200a的抑制后，實時熒光定量PCR檢測48h抑制效率分別約為50.9％和54.4％。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，HT29和HCT116細胞的下調miR-200a組在mRNA水平DNMT1表達

11、顯著升高(F=38.278，P=0.000)(F=21.433，P=0.002); Western Blot實驗結果顯示，HT29和HCT116細胞的下調miR-200a組的DNMT1在蛋白水平表達量顯著升高。劃痕實驗顯示，HT29和HCT116細胞的下調miR-200a組的遷移能力較對照組顯著增強;Transwell小室細胞運動實驗結果顯示，HT29和HCT116細胞的下調miR-200a組穿膜數(shù)量較對照組顯著增多。
　　 3

12、.對miR-200a低表達的SW620和Lovo細胞進行miR-200a的過表達后，實時熒光定量PCR檢測48h miR-200a/mimics組表達倍數(shù)為negative control組2053倍和1020倍。實時熒光定量PCR檢測結果顯示， SW620和LoVo細胞的上調miR-200a組在mRNA水平DNMT1表達顯著下降（F=19.221，P=0.005）(F=29.498，P=0.000);Western Blot實驗結果顯

13、示，SW620和LoVo細胞的上調miR-200a組的DNMT1在蛋白水平表達量顯著降低。劃痕實驗顯示，SW620和LoVo細胞的上調miR-200a組的遷移能力較陰性對照組顯著減弱。Transwell小室細胞運動實驗結果顯示，SW620和LoVo細胞的上調miR-200a組的穿膜數(shù)量較對照組顯著減少。
　　 4.對HCT116和HT29細胞進行TGF-β1激活TGF-β通路處理，對SW620和LoVo細胞進行U0126抑制ER

14、K通路處理。通過免疫印跡方法檢測通路中標志物表達量。結果顯示:TGF-β誘導組的TβRⅡ、p-ERK1/2表達量比其空白表達增強;在SW620和Lovo細胞中，U0126抑制組的p-ERK1/2表達量比其空白組表達減弱，而TβRⅡ表達量沒有變化。
　　 5.在HCT116、HT29、SW620和Lovo四株細胞中分別下調和上調miR-200a，檢測TGF-β1表達量。結果顯示:四株細胞的實驗組與對照組的TGF-β1表達量差異不具

15、有統(tǒng)計學意義。
　　 6.通過軟件http://www.targetscan.org/預測到TGF-β亞型中的TGF-β2與miR-200a存在兩個8bp的結合位點。miR-200a可能通過這兩個結合位點實現(xiàn)對TGF-β通路的調控。
　　 結論:
　　 1.miR-200家族的表達受到甲基化修飾的調控，并且此調控成為影響表達量的主要原因。miR-200家族啟動子區(qū)域甲基化與患者年齡不具相關性，與患者性別，腫瘤大小

16、，是否發(fā)生轉移以及預后具有相關性。
　　 2.miR-200家族甲基化程度與結直腸癌患者生存期密切相關，可以作為預后指標。
　　 3.結直腸癌細胞株中miR-200a表達量降低促使癌細胞的運動轉移能力增強，基因組甲基化能力增強。
　　 4.結直腸癌細胞株中miR-200a表達量升高促使癌細胞的運動轉移能力減弱，基因組甲基化能力減弱。
　　 5.miR-200a可以通過TGF-β—ERK通路實現(xiàn)對DNMT1