HepG2細(xì)胞脂肪變模型中氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及藥物干預(yù).pdf

1、第一部分脂肪酸誘導(dǎo)建立HepG2 細(xì)胞脂肪變模型
　　 目的：建立體外脂肪肝細(xì)胞模型，為針對(duì)性地研究非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：油酸和軟脂酸比例為2 比1 的不同濃度梯度的混合脂肪酸孵育HepG2細(xì)胞，12 小時(shí)和24 小時(shí)后分別用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力。0.5mM 和1mM 的混合脂肪酸分別孵育HepG2 細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行油紅O 染色和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量的測(cè)定。
　　 結(jié)果：

2、0.125～0.5mM 的混合脂肪酸對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯抑制作用，1mM 的混合脂肪酸對(duì)細(xì)胞毒性較大。油紅O 染色可見脂肪酸組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)染色脂質(zhì)增多，1mM 脂肪酸干預(yù)組在24 小時(shí)即可見細(xì)胞有壞死浮起。脂肪酸干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)TG 含量在12 小時(shí)起較正常對(duì)照組顯著增加（P<0.05）。
　　 結(jié)論：油酸和軟脂酸比例2:1、濃度為0.5mM 的混合脂肪酸既能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪變性，又不會(huì)使細(xì)胞大量

3、裂解死亡，可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞成功建立脂肪肝細(xì)胞模型。
　　 第二部分 HepG2 細(xì)胞脂肪變模型中氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及藥物干預(yù)
　　 目的：檢測(cè)HepG2 細(xì)胞脂肪變模型中氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生情況，探討抗氧化劑維生素E 和分子伴侶4-苯基丁酸（PBA）對(duì)其的影響。
　　 方法：0.5mM 和1mM的混合脂肪酸分別干預(yù)HepG2 細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量和超氧化物

4、歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）水平。Real-timePCR 方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP 和GRP78 mRNA 的表達(dá)水平。將1mg/L 的維生素E 和2mM 的PBA 分別干預(yù)脂肪變性HepG2 細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)MDA、SOD、GSH 水平和CHOP、GRP78 mRNA 表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，脂肪酸干預(yù)組HepG2 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量明顯增加，SOD 和GSH 水平顯著降低，

5、而CHOP、GRP78 mRNA 的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。維生素E 和PBA 干預(yù)均可使脂肪變性HepG2 細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯下降，SOD 和GSH 水平顯著升高（P<0.05）。PBA 還下調(diào)CHOP 和GRP78 mRNA 的表達(dá)水平（P<0.05），但維生素E 對(duì)其表達(dá)無影響。
　　 結(jié)論：HepG2 細(xì)胞脂肪變性時(shí)發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抗氧化劑維生素E 能減輕氧化應(yīng)激，化學(xué)分子伴侶PBA 兼具有改

6、善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激的雙重作用。
　　 第三部分 HepG2 細(xì)胞脂肪變模型中Caspase-3 活性的變化及藥物干預(yù)
　　 目的：檢測(cè)HepG2 細(xì)胞脂肪變模型中Caspase-3 活性的變化，探討抗氧化劑維生素E 和分子伴侶PBA 對(duì)其的影響。
　　 方法：0.5mM 和1mM 的混合脂肪酸分別干預(yù)HepG2 細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 活性。將1mg/L 的維生素E 和2mM的PBA

7、分別干預(yù)脂肪變性HepG2 細(xì)胞，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Caspase-3 活性的變化。
　　 結(jié)果：脂肪酸組HepG2 細(xì)胞Caspase-3 活性較正常對(duì)照組顯著升高（P<0.05），維生素E 和PBA 干預(yù)組細(xì)胞Caspase-3 活性均較脂肪酸組明顯下降（P<0.05）。
　　 結(jié)論：脂肪酸可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞Caspase-3 活性升高，抗氧化劑維生素E 和化學(xué)分子伴侶PBA均能下調(diào)脂肪變性HepG2 細(xì)胞Cas