馬兜鈴酸Ⅰ以及CD40信號對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響.pdf

1、研究背景： 馬兜鈴酸(Aristolochic acid，AA)是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物中的一類菲類化合物，具有抗腫瘤、增強免疫功能和提升白細胞等作用，因而廣泛用于風濕性關節(jié)炎、毒蛇咬傷和創(chuàng)口化膿。90年代開始，因服用含AA的藥物所致的“馬兜鈴酸腎病”(aristolochic acid nephropathy，AAN)在國內(nèi)外醫(yī)藥學界受到了廣泛的關注。不同劑量、不同作用時間的AA可引起腎小管上皮細胞(RTECs)出現(xiàn)不同程度和不

2、同類型的結構改變。體內(nèi)外實驗均表明，AA引起的腎損害可能涉及腎小管上皮細胞損傷、腎間質(zhì)成纖維細胞增生或活性增高、腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、RTECs轉分化及肌成纖維細胞(MyoF)聚集以致腎間質(zhì)纖維化。目前對血管內(nèi)皮細胞損傷參與慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程的研究較多，但馬兜鈴酸對內(nèi)皮細胞的作用目前報道較少。 目的： 本實驗應用馬兜鈴酸I作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，觀察馬兜鈴酸I對內(nèi)皮細胞的增殖、凋亡、分泌、轉化

3、方面的影響。 方法： 1)MTT比色法：將處于對數(shù)生長狀態(tài)的HUVEC接種到96孔板，加入不同濃度(10、20、40、80μg/ml)的馬兜鈴酸I刺激72小時，同時設陰性對照，檢測馬兜鈴酸I對HUVEC增殖的影響。 2)流式細胞儀：將HUVEC經(jīng)不同濃度(20、40、80μg/ml)的馬兜鈴酸I刺激72小時，檢測馬兜鈴酸I對HUVEC凋亡的影響。 3)酶聯(lián)免疫法：將HUVEC經(jīng)不同濃度(20、40、80μ

4、g/ml)的馬兜鈴酸1分別刺激一、二、三、四、五天，檢測馬兜鈴酸I引起HUVEC分泌TGF-β1的變化：激發(fā)型CD40單抗5C11經(jīng)不同濃度(2.5、5.0、10μg/ml)刺激HUVEC一、二、三、四、五天，檢測上清液中TGF-β1的變化。4)細胞免疫組化：將HUVEC經(jīng)40μg/ml的馬兜鈴酸I刺激72h，細胞免疫組化的方法測定F1k-1和α-SMA的表達，觀察內(nèi)皮細胞轉化的情況。 結果： 1)馬兜鈴酸I刺激72h后

5、，10μg/ml組和20μg/ml組細胞增殖未受抑制，40μg/ml組可見細胞增殖受到抑制，但無統(tǒng)計學意義，80μg/ml組細胞增殖明顯受到抑制，有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2)馬兜鈴酸I在20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml時均可引起HUVEC明顯的凋亡。 3)馬兜鈴酸I在20μg/ml濃度時，可明顯促進TGF-β1的分泌，結果有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而40μg/ml組和80μg/ml組無統(tǒng)計學

6、意義。 4)5C11刺激后HUVEC分泌TGF-β1明顯增加，其中2.5μg/ml濃度刺激TGF-β1分泌的增加顯著，具有統(tǒng)計學意義。 5)經(jīng)馬兜鈴酸I40μg/ml刺激后，未見正常血管內(nèi)皮細胞標記分子Flk-1的表達下調(diào)和肌成纖維細胞標記分子α-SMA的表達上調(diào)。 討論： 腎微血管內(nèi)皮細胞損傷與腎小管問質(zhì)纖維化的關系是近幾年研究的熱點。本研究即采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，馬兜鈴酸I刺激后細胞的增殖和