鼻咽癌中STGC3基因的表達及調(diào)控其表達CNE2細胞系的建立.pdf

1、第一部分 STGC3蛋白在鼻咽癌組織中的表達及其意義
　　目的:通過觀察STGC3蛋白質(zhì)在鼻咽癌和正常鼻咽活檢組織中的表達及分布情況,探討STGC3在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:首先制備兔抗人STGC3多克隆抗體;運用免疫組化SP方法,檢測40例鼻咽癌組織及21例正常鼻咽組織中STGC3蛋白的表達與定位;運用Western blot法,檢測20例鼻咽癌和20例正常鼻咽活檢標本中STGC3蛋白質(zhì)的表達水平。
　　

2、結(jié)果:
　　(1)免疫組化結(jié)果:正常鼻咽粘膜組織STGC3蛋白定位于上皮細胞胞核及胞漿,陽性表達率為85.71％(18/21),鼻咽癌中 STGC3主要在癌細胞的胞漿表達,胞核表達較少,陽性表達率為30.00%(12/40),明顯低于正常對照組織,差異具有顯著性,P<0.05;鼻咽癌 STGC3陽性表達率在臨床Ⅰ-Ⅱ期(43.75%)明顯高于Ⅲ-Ⅳ期(20.83%),且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌病例其陽性率(38.10%)明顯高于有淋巴

3、結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌病例陽性表達率(21.05%),P<0.05;(2)Western blot結(jié)果:鼻咽癌 STGC3相對表達量(STGC3/actin)明顯低于對照正常組織(0.324±0.185;0.978±0.213),P<0.05。
　　結(jié)論:STGC3蛋白在正常鼻咽粘膜和鼻咽癌中定位于細胞的胞核及胞漿。正常鼻咽粘膜和鼻咽癌STGC3的表達水平及定位有差別,鼻咽癌組織中STGC3蛋白的表達水平明顯低于正常對照組織,且鼻咽癌中核

4、表達減少。 STGC3陽性表達率與鼻咽癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關,臨床分期越早,表達率越高,且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌病例陽性率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌病例,表明STGC3表達下調(diào)或缺失在鼻咽癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移中起一定作用。
　　第二部分 Tet調(diào)控STGC3基因表達CNE2細胞系建立及其功能初步研究
　　目的:本研究利用Tet-on調(diào)控系統(tǒng),建立受強力霉素誘導STGC3基因表達的CNE2細胞系,為進一步研究STGC3

5、基因功能提供一個理想的實驗平臺。
　　方法:構(gòu)建重組真核表達載體 pRevTRE-STGC3;先后將調(diào)控質(zhì)粒 pRevTet-on和反應質(zhì)粒pRevTRE-STGC3轉(zhuǎn)染入CNE2細胞,并用G418和潮霉素分別進行兩輪篩選,以1mg/LDox誘導,運用RT-PCR選擇高誘導活性、低背景的細胞克隆。用不同濃度強力霉素(Doxcycline, Dox)誘導CNE2/Tet/TRE-STGC細胞, RT-PCR和Western blot

6、法檢測STGC3的表達,確定Dox的最佳誘導濃度。用此濃度 Dox分別誘導CNE2、CNE2/Tet/TRE、CNE2/Tet/TRE-STGC3三組細胞,通過HE染色、繪制生長曲線、軟瓊脂集落形成實驗及流式細胞儀分析等方法,觀察STGC3基因高表達后CNE2細胞形態(tài)、增殖速度、克隆形成率和細胞周期分布變化。
　　結(jié)果:CNE2/Tet/TRE-STGC細胞對Dox誘導敏感,并且STGC3基因表達呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,Dox的最佳

7、誘導濃度是3mg/L。以3mg/LDox誘導CNE2、CNE2/Tet/TRE、CNE2/Tet/TRE-STGC3三組細胞:顯微鏡下觀察細胞形態(tài)顯示轉(zhuǎn)基因組細胞核漿比例減少;繪制生長曲線表明轉(zhuǎn)基因組較CNE2組和轉(zhuǎn)空載體組生長速度減慢,P<0.05;軟瓊脂集落形成實驗顯示CNE2組、空載體組、轉(zhuǎn)STGC3基因組克隆形成率分別為(36±2.5)%、(34±3.1)%、(10±2.7)%,轉(zhuǎn)STGC3基因組克隆形成能力較兩對照組顯著降低(