血管內(nèi)皮細(xì)胞在放射性肺損傷中的作用及茶多酚放射防護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)給予大鼠右肺不同的單次照射劑量，建立起大鼠放射性肺損傷模型，利用CT影像學(xué)手段，結(jié)合病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，免疫組織化學(xué)、Western blotting等檢測(cè)技術(shù)，觀察、分析大鼠放射性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及其可能的發(fā)病機(jī)制，尤其是重點(diǎn)探討血管內(nèi)皮細(xì)胞在放射性肺損傷中的作用；本研究通過(guò)照射人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的方法，建立體外放射損傷模型，觀察放射對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)；并以體外實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)茶多酚體外防護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞放射損傷的

2、在體實(shí)驗(yàn)研究，綜合觀察、分析茶多酚對(duì)放射性肺損傷的干預(yù)作用及其可能機(jī)制。 方法：本研究分三個(gè)部分：第一部分的實(shí)驗(yàn)方法包括：采用6~Co治療機(jī)產(chǎn)生的1，線單次照射大鼠的右肺，照射劑量分別為0 Gy、7.0 Gy、14.4Gy，觀察時(shí)點(diǎn)為照射后1天(以下以d表示)、7天(1周)、30天(1月)和90天(3月)，取對(duì)照組及各照射組大鼠的肺組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，包括：①大鼠放射性肺損傷的病理學(xué)觀察，包括大體病變、H-E染色光學(xué)顯微鏡；②肺纖

3、維化改變的檢測(cè)包括：分光光度與酸解法測(cè)定肺組織羥脯氨酸濃度；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織TGF-β1的表達(dá)；③TUNEL法檢測(cè)肺組織的細(xì)胞凋亡；④Western blotting檢測(cè)肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD34、CD105和VEGF的表達(dá)水平；⑤免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織炎性因子INF-α。第二部分，血管內(nèi)皮細(xì)胞照射后細(xì)胞凋亡的體外研究，用60Coγ線單次照射體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，劑量分別為0 Gy、7.0 Gy、14.4Gy和3

4、0.0Gy，細(xì)胞凋亡檢測(cè)指標(biāo)包括：①血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷的“彗星”實(shí)驗(yàn)；②血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率采用Annemn V/PI染色法后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；③血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3的活性與細(xì)胞線粒體膜電位變化采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。第三部分，茶多酚放射性肺損傷的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用60Coγ線14.4Gy單次照射建立大鼠肺放射損傷模型和體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，分別采用500mg/kg劑量的茶多酚進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)和10μg/L、100μg/L、100

5、0μg/L三個(gè)數(shù)量級(jí)的茶多酚進(jìn)行體外干預(yù)，分別檢測(cè)：①體外細(xì)胞凋亡檢測(cè)指標(biāo)：采用Annexin V/PI染色法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3的活性和線粒體膜電位變化，以觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡改變情況；②體內(nèi)試驗(yàn)指標(biāo)：茶多酚干預(yù)后對(duì)放射性肺損傷大鼠血清SOD與MDA的檢測(cè)采用比色法，采用Western blotting法檢測(cè)茶多酚干預(yù)后肺損傷組織血管中CD34、CD105、VEGF表達(dá)的變化，免疫組織

6、化學(xué)法檢測(cè)茶多酚干預(yù)后肺損傷組織中TNF-α表達(dá)的變化。第三部分，茶多酚對(duì)放射性肺損傷的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為：①體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10μg/L，干預(yù)組無(wú)顯著改變；100μg/L干預(yù)組與1000μg/L干預(yù)組的早期凋亡率分別為23.1％±5.8％、20.2％±4.6％，顯著低于14.4 Gy放射損傷組，其中1000μg/L干預(yù)組晚期凋亡陽(yáng)性率為8.9％±2.6％，也顯著低于14.4 Gy放射損傷組；100μg/L干預(yù)組的線粒體損傷率為24.3％±4

7、.8％，顯著低于14.4Gy放射損傷組；1000μg/L干預(yù)組Caspase-3陽(yáng)性率與線粒體損傷率分別為16.2％±3.9％、18.3％±5.8％，兩組檢測(cè)指標(biāo)均顯著低于14.4 Gy放射損傷組。進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①與正常對(duì)照組比較，14.4 Gy組大鼠SOD水平在照射后1d明顯升高，7d則變化不大，30d、90d時(shí)則明顯降低；在茶多酚干預(yù)后，除第7天外，大鼠SOD的水平均高于正常對(duì)照組，其中30d和90d明顯高于14.4 Gy照

8、射組大鼠SOD的水平；茶多酚干預(yù)組，MDA水平除第7天外，均顯著高于正常對(duì)照組；但與14.4 Gy組比較，MDA水平明顯降低；②14.4 Gy組與茶多酚干預(yù)組大鼠肺部做定量的蛋白印跡測(cè)定CD34、CD105、VEGF表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)茶多酚干預(yù)組與放射損傷14.4 Gy組之間的表達(dá)水平無(wú)顯著差別；③盡管經(jīng)茶多酚干預(yù)，但照射后肺部出現(xiàn)呈TNF-α陽(yáng)性表達(dá)的吞噬細(xì)胞以及炎性細(xì)胞均無(wú)明顯降低的趨勢(shì)，依然為陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論：⑴放射性肺損傷呈