實(shí)時定量PCR技術(shù)在油菜菌核病菌對多菌靈抗藥性監(jiān)測中的應(yīng)用研究.pdf

1、　　油菜菌核病是我國油菜主要產(chǎn)區(qū)的重要病害，嚴(yán)重影響著油菜生產(chǎn)，目前防治菌核病的藥劑主要是以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑。由于這類藥劑的高度專化性，作用位點(diǎn)單一，加上施用頻率高，一般使用2～3年后許多病原菌很快會出現(xiàn)抗藥性問題?，F(xiàn)有研究證明，β-微管蛋白198位氨基酸由谷氨酸(G1u)突變?yōu)楸彼?Ala)是導(dǎo)致核盤菌產(chǎn)生對多菌靈田間抗藥性的主要原因?！　”疚母鶕?jù)MBCHR菌株的點(diǎn)突變設(shè)計(jì)了2種實(shí)時定量PCR檢測方法：第一種方法利用兩

2、條兩端分別標(biāo)記了不同發(fā)光基團(tuán)的Taqman熒光探針可以與各自模板特異性結(jié)合發(fā)出不同熒光的原理來定量敏感和抗性核盤菌的數(shù)量；第二種方法在ASO-PCR檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合了SYBRGREENI熒光染料可以與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的的原理實(shí)現(xiàn)了對抗性核盤菌和全體樣本的實(shí)時定量檢測?！　≡赥aqman熒光探針實(shí)時定量PCR方法的研究中，設(shè)計(jì)了一對可以擴(kuò)增出包含突變位點(diǎn)片段的通用引物TYF、TYR和敏感探針及抗性探針。實(shí)驗(yàn)中表明TaqMan熒光探

3、針多重定量PCR技術(shù)不適用于油菜菌核病菌對多菌靈抗藥性突變這一單堿基的點(diǎn)突變類型的檢測?！　≡赟YBRGREENI熒光染料實(shí)時定量PCR方法的研究中，根據(jù)ASO-PCR檢測的原理用198位突變密碼子作為3'末端堿基設(shè)計(jì)了1對引物RFP4、RRP來擴(kuò)增產(chǎn)生突變的抗性核盤菌β-微管蛋白基因片段，根據(jù)S.sclerotiorumβ-微管蛋白基因內(nèi)含子與其它常見絲狀真菌的差異設(shè)計(jì)了特異性引物SclSF、SclAF來擴(kuò)增核盤菌的特異性片段，這樣

4、通過這兩對引物的特異性保證了檢測的可靠性和準(zhǔn)確性；在定量方法上，選用SYBRGREENI熒光染料使檢測靈敏度大為提高，可以檢測出O.0028ng(3.17×103copy)的模板含量，是普通ASO-PCR方法的十倍以上；采用從菌核直接提取基因組DNA的方法，并且不需要對每個菌株單獨(dú)處理，大大節(jié)省了檢測時間和工作量?！　⊥ㄟ^SYBRGREENI熒光染料實(shí)時定量PCR法建立了油菜菌核病菌對多菌靈田間抗藥性檢測的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)方程對