仿生電刺激在離體心肌細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、[目的] 研究仿生電刺激對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用及強(qiáng)度。 [方法] 1.按不同接種密度、血清濃度、首次換液時(shí)間及PH值分組接種MSCs，10天后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，探討其適宜的培養(yǎng)條件，采用MTT法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，免疫組織化學(xué)化檢測(cè)MSCs CD44、CD34表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs生長(zhǎng)周期。 2.采用兩種不同次序的胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化方法（方法10.125％胰酶+

2、0.1％Ⅱ型膠原酶混合液逐次消化心肌組織；方法20.1％Ⅱ型膠原酶單獨(dú)消化心肌組織數(shù)次基礎(chǔ)上再單用0.125％胰酶逐次消化心肌組織），分離新生大鼠的心肌細(xì)胞，比較兩種消化方法獲得心肌細(xì)胞數(shù)量及存活率的差別，同時(shí)進(jìn)行心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)變化，并以細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行心肌細(xì)胞純度鑒定。 3.將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（經(jīng)DAPI標(biāo)記）與心肌細(xì)胞按固定比例共同培養(yǎng)（MSCs/心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系），按是否給予仿生電刺激分為非電刺激組和電刺

3、激組，刺激組每日給予仿生電刺激2h，頻率0.5Hz、脈寬5ms、電壓10V（電流強(qiáng)度20μA），每組又以實(shí)驗(yàn)干預(yù)培養(yǎng)時(shí)間（3、5、7天）分為三個(gè)亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組）。分別于實(shí)驗(yàn)的第3、5、7天觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cTnT的表達(dá)情況。 4.取傳代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MSCs，吸棄DMEM低糖培養(yǎng)液，換上含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液；給予仿生電刺激的為實(shí)驗(yàn)干預(yù)組（每天給予電刺激2h，刺激7天），沒(méi)有

4、給予仿生電刺激的為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；仿生電刺激的頻率為0.5Hz，脈寬5ms，按照刺激電壓強(qiáng)度5V、10V、20V（分別對(duì)應(yīng)的電流強(qiáng)度為10μA、20μA、40μA）分為三個(gè)亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組）；電刺激干預(yù)7天后，分別取實(shí)驗(yàn)干預(yù)各亞組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞行cTnT抗體免疫熒光染色，觀察各組細(xì)胞有無(wú)出現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白的表達(dá)。 [結(jié)果] 1.MSCs貼壁呈纖維樣生長(zhǎng)，細(xì)胞較佳接種密度為5×105/c㎡，合適血清濃度為10％，較

5、合適首次換液時(shí)間為48h，培養(yǎng)液較佳的PH值為7.2左右；MSCs經(jīng)歷生長(zhǎng)停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期；MSCs膜上存在CD44陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)CD34表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs大部分處于靜止G0/G1期。 2.兩種不同次序消化方法心肌細(xì)胞分離良好，收獲細(xì)胞數(shù)量及存活率高，方法2細(xì)胞存活率高于方法1；分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)可貼壁搏動(dòng)生長(zhǎng)，免疫熒光顯示培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度達(dá)95％以上。 3.離體心肌微環(huán)境誘導(dǎo)MSCs中，仿生電刺激組

6、細(xì)胞較非電刺激組生長(zhǎng)良好，實(shí)驗(yàn)第5天非電刺激組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有cTnT表達(dá)，電刺激組有少數(shù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)cTnT表達(dá)。實(shí)驗(yàn)第7天非電刺激組和電刺激組MSCs均有cTnT表達(dá)，電刺激組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cTnT陽(yáng)性細(xì)胞率高于非電刺激組。 4.仿生電直接刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞7天后，倒置顯微鏡下觀察，各實(shí)驗(yàn)干預(yù)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的MSCs細(xì)胞均明顯鋪開(kāi)生長(zhǎng)，形態(tài)、大小不一；分別取實(shí)驗(yàn)干預(yù)的各亞組細(xì)胞（按刺激電壓強(qiáng)度5v、10v、2