ST6Gal I siRNA與ASO對宮頸癌及結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征之一，也是導致腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是—個多階段復雜的過程，其中細胞表面糖復合物的異常表達特別是糖復合物末端的唾液酸化改變被認為與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal I)可催化活化的唾液酸以α2,6-糖苷鍵的形式連接到細胞膜表面的N-乙酰乳糖胺上，成為腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)；(Extracellular matrix， ECM)之間相互識別的重要受體。在宮頸癌與結(jié)腸癌細胞中

2、，編碼ST6Gal I的基因均高表達，該基因的高表達被認為是引起宮頸癌、結(jié)腸癌高侵襲力的主要原因之一。 反義核酸技術(shù)是根據(jù)核酸間的堿基互補原理，用生物合成或人工合成的互補反義核酸或其化學修飾物與細胞內(nèi)的特定核酸結(jié)合以抑制或封閉其表達。其中RNA干擾(RNA interference，RNAi)及反義寡聚脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)技術(shù)是近年研究基因表達調(diào)控的兩種常用的熱點反義

3、核酸技術(shù)，均顯示出良好的應(yīng)用背景。 本研究通過探討靶向ST6Gal I 的小分子干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)和與其相同及不同靶點的ASO聯(lián)合應(yīng)用，對宮頸癌HeLa細胞與結(jié)腸癌 SW480細胞的黏附和侵襲力的影響，以期為RNAi及ASO技術(shù)在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的機制和應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。 方法: (1) 設(shè)計并合成靶向ST6Gal I的siRNA及ASO，用脂質(zhì)體IJpofect

4、amine 2000包裹后轉(zhuǎn)染MeI_枷胞及SW480細胞。實驗設(shè)4個對照組：空白對照組、脂質(zhì)體對照組、非特異性siRNA組、非特異性ASO組及5個實驗組：siRNA組、AS01組(與siRNA相同靶點)、AS02組(與siRNA不同靶點)、 siRNA+ASO<,1>組及siRNAl斗ASO<,2>組，用RT-PCR測定轉(zhuǎn)染后各組細胞中 ST6Gal I mRNA表達水平。擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠顯色， Gone Geni

5、us凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度值，以目的基因ST6Gal I與管家基因β-actin 灰度值的比值來反映ST6Gal I mRNA的表達量，比值越高說明目的基因表達越高。 (2)采用特異性識別唾液酸受體的異硫氰酸熒光素標記的接骨木凝集素 (FITC-SNA)作用于各組細胞，‘通過流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞表面α2,6-唾液酸含量，以平均熒光強度(fluorescence intensity,，F(xiàn)I)表示細胞表面α2,6-唾液酸含

6、量，F(xiàn)I值越高，說明細胞表面α2,6-唾液酸含量越高；同時通過免疫熒光技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察各組細胞表面α2,6-唾液酸的表達隋況。 (3)用CytoMatrix<'TM>細胞黏附試劑盒，檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞對ECM的黏附力。用490nm波長下測定的吸光度值即A<,490>值的高低表示細胞對ECM黏附力的大小，值越高說明細胞對ECM黏附力越高。 (4)用CytoMatdx<'TM>細胞侵襲分析試劑盒，檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞對

7、ECM的侵襲力。以穿膜細胞數(shù)表示細胞侵襲力的大小，穿膜細胞數(shù)越多表示細胞侵襲力越大。 結(jié)論： (1)ST6Gal I siRNA與ASO均可調(diào)低HeLa細胞及SW480細胞中ST6Cral I的mRNA表達水平。siRNA與不同靶點的ASO合用，下調(diào)HeLa細胞及SW480細胞中ST6Cral I的mRNA表達水平強于單獨應(yīng)用siRNA組，而與相同靶點的ASO合用，下調(diào)HeLa細胞及SW480細胞中ST6Gal I的mR

8、NA表達水平與單獨應(yīng)用siRNA組無明顯差異。 (2)ST6Gal I siRNA與ASO均可降低HeLa及SW480細胞表面α2，6-唾液酸含量。siRNA與不同靶點的ASO合用，降低HeLa細胞及SW480細胞表面α2，6-唾液酸含量強于單獨應(yīng)用siRNA組，而與相同靶點的ASO合用，降低HeLa細胞及SW480細胞表面α2,6-唾液酸含量與單獨應(yīng)用siRNA組無明顯差異。 (3)ST6Gal I siRNA與ASO

9、均可調(diào)低HeLa及SW480細胞對ECM的黏附力。siRNA與不同靶點的ASO合用，調(diào)低HeLa細胞及SW480細胞對ECM黏附力的作用強于單獨應(yīng)用siRNA組，而與相同靶點的ASO合用，調(diào)低HeLa細胞及SW480細胞對ECM黏附力的作用與單獨應(yīng)用siRNA組無明顯差異。 (4)ST6Gal I siRNA與ASO均可調(diào)低HeLa及SW480細胞對ECM的侵襲力。siRNA與不同靶點的ASO合用，調(diào)低HeLa細胞及SW480細