兒童哮喘iNOS基因5′調(diào)控區(qū)(CCTTT)n缺失的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和目的;支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的慢性炎癥,以氣道壁重建和非特異性氣道高反應(yīng)性為特征。雖然環(huán)境因素在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用,但是大量受累同胞和家系研究己證實哮喘具家族聚集性,表明哮喘有明顯的遺傳傾向。通過基因組掃描、候選基因技術(shù),確認哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳病,但哪些基因參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展尚未明確。 一氧化氮(nitricoxide,NO)作為一種可在細胞間自由擴散的

2、信使分子,是一種反應(yīng)性極強的自由基,具有非常強烈的細胞毒性作用,在神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和血管舒張調(diào)節(jié)等生理與病理過程中起重要作用。NO以分子氧和L-精氨酸為底物,由一氧化氮合酶(NOsynthase,NOS)催化合成。在炎癥細胞因子等誘導(dǎo)下,iNOS編碼基因被激活,大量而持續(xù)合成NO,介導(dǎo)炎癥、休克、哮喘等疾病的發(fā)生。目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)細胞來源、表達方式和活性調(diào)節(jié)不同的3種NOS同工酶,分別為神經(jīng)元型NOS(neuronalNOS,nNOS

3、)、誘導(dǎo)型NOS(inducibleNOS,iNOS)和內(nèi)皮細胞型NOS(endothelialNOS,eNOS)。3種NOS由位于不同染色體上的基因所編碼。人iNOS基因位于第17號染色體長臂(17q11.2-17q12),全長約37kb,含有26個外顯子。iNOS可在多種類型的細胞中通過IL-1、IFN-α、TNF-γ等細胞因子和其他介質(zhì)的刺激作用而誘導(dǎo)表達。iNOS基因5’-端調(diào)控區(qū)內(nèi)存在一個CCTTT串聯(lián)重復(fù)的多態(tài)性位點,這一多

4、態(tài)性基因座已在北愛爾蘭的糖尿病患者中證實與微血管病變有關(guān)。有實驗表明CCTTT串聯(lián)重復(fù)序列的變化對iNOS基因的轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生不同影響,但中國人群中有關(guān)iNOS基因CCTTT串聯(lián)重復(fù)序列與哮喘的相關(guān)性目前尚未見報道。 本實驗應(yīng)用PCR-STR方法,對iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性進行檢測和分析,旨在了解iNOS基因表達、調(diào)控與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)情況,為兒童哮喘疾病基因篩選和定位提供資料。 材料與方法;本實驗分為哮喘組

5、與健康對照組,來自鄭州市兒童醫(yī)院,哮喘組77例為本院哮喘門診就診和呼吸科住院病人,其中男43例,女34例,年齡2歲~12歲,按照全國兒科哮喘協(xié)作組1998年修訂的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為哮喘,并按標(biāo)準(zhǔn)劃分為輕度、中度和重度三組;健康對照組102例為本院門診和保健科健康體檢兒童,男49例,女53例,年齡在2歲~10歲,均無哮喘史、哮喘家族史和典型過敏史。 抽取受檢者外周靜脈血,EDTA抗凝,采用經(jīng)典的SDS-蛋白酶K-酚-氯仿等方法提取

6、基因組DNA。PCR擴增iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列,6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠經(jīng)過固定、染色、顯色三步處理至帶型清晰,判讀擴增條帶。 PCR檢測iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列基因片段可見176bp的條帶,重復(fù)三次擴增未顯帶但其他STR位點擴增顯帶者視為缺失型,統(tǒng)計學(xué)分析采用直接計數(shù)法計算哮喘組和正常對照組的基因型,病例組和對照組間iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列缺失的差異用X2檢驗。以α=0.05作為顯著性

7、水準(zhǔn),所有統(tǒng)計學(xué)分析都在SPSS11.0軟件包中完成。 結(jié)果;(1)iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列PCR檢測結(jié)果:77例哮喘患兒中63例5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列缺失,缺失率81.82%;對照組102例,25例缺失,缺失率24.51%,對照組與病例組基因缺失率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異有顯著性(x2=57.66,P<0.05)。 (2)哮喘患兒病情與iNOS基因5’調(diào)控區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列缺失的關(guān)系:77例哮喘患兒中,輕度患者19

8、例,缺失型11例,缺失率57.89%;中型43例,缺失型38例,缺失率88.37%;重度15例,缺失型14例,缺失率93.33%。統(tǒng)計學(xué)分析組間差異,輕度、中度患兒之間差異無顯著性(X21=0.295,P>0.05),中度與重度之間、輕度與重度之間比較,均有顯著性差異(x22=7.386,P<0.05;X23=7.383,P<0.05)。輕度與中度+重度組比較差異有顯著性(x24=9.705,P<0.05)。 (3)哮喘患兒年齡

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