苦參素對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎大鼠防治作用的研究.pdf

1、目的:觀察苦參素(MAT)對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(EAE)的防治作用，探討MAT對EAE大鼠防治作用的機制，為其治療多發(fā)性硬化(MS)尋找理論依據。
　　方法:將6-7周齡、體重180-220g的雌性Wistar實驗大鼠50只按每組10只的數量隨機分成5組。以豚鼠脊髓勻漿(GPSCH)作為致敏抗原，完全福氏佐劑(CFA)作為抗原佐劑，兩者混合后制成致敏劑對隨機選出的4組大鼠進行致敏后建立EAE模型，并設為EAE對照組，低、中、

2、高劑量MAT組(MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組)，剩余1組為正常對照組。自造模當日起，正常對照組和EAE對照組不做任何處理常規(guī)飼養(yǎng)，MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組連續(xù)15日分別應用MAT膠囊50 mg/kg·d、100mg/kg·d、200mg/kg·d劑量灌胃一次。造模后需每日定時觀察各組Wistar實驗大鼠的臨床表現如精神飲食、體重變化、肢體活動等以確定發(fā)病潛伏期、進展期，并進行高峰期神經功能障礙評分。未發(fā)病的大

3、鼠觀察1月后處死，發(fā)病的EAE大鼠以連續(xù)3天觀察神經功能障礙評分未加重，或出現嚴重共濟失調、肢體完全癱瘓、瀕死的時間作為實驗終止時間。同時在實驗終止時留取大鼠外周靜脈血、腦組織等保存待檢測。通過病理檢查、ELISA等檢測方法，觀察大鼠發(fā)病高峰期腦組織炎癥病理改變及腦組織勻漿中Th1、Th2、Th17代表性細胞因子濃度變化和靜脈血髓鞘堿性蛋白(MBP)濃度、T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+)比例變化。根據EAE和MS的免疫機制選定γ-干

4、擾素(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-17(IL-17)分別作為Th1、Th2、Th17代表性細胞因子。通過SPSS17.0軟件對數據進行統計學分析。
　　結果:
　　1.大鼠發(fā)病情況:
　　(1)臨床表現:正常對照組大鼠精神、飲食、睡眠及活動同平時，未見有發(fā)病表現。EAE大鼠造模后不同程度出現毛色暗淡、精神差、飲食睡眠下降、活動減少、尾巴無力、肢體癱瘓、大小便失禁，甚至抽搐死亡等現象。各MAT組

5、大鼠的臨床表現較EAE對照組輕，其中以MAT-H組最輕。
　　(2)發(fā)病潛伏期:EAE大鼠發(fā)病潛伏期時間以EAE對照組最短，為9.30±0.94天;MAT-H組最長，為16.60±0.97天。與EAE對照組相比，各MAT組潛伏期時間延長顯著(P＜0.01);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠潛伏期時間依次延長，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.01)。
　　(3)疾病進展期:各組EAE大鼠疾病進展期時間以EA

6、E組最長，為7.20±1.14天;MAT-H組最短，為2.90±0.74天。與EAE對照組相比，各MAT組進展期時間顯著變短(P＜0.01);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠進展期時間依次縮短，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.01)。
　　(4)發(fā)病高峰期神經功能障礙評分:疾病高峰期各組EAE大鼠神經功能障礙評分以EAE對照組最高，為3.70±0.95分;MAT-H組最低，為2.00±0.82分。與EAE對照組

7、相比，各MAT組神經功能障礙評分顯著下降(P＜0.01、P＜0.05);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠神經功能障礙評分依次降低，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.05)。
　　(5)發(fā)病癥狀嚴重程度及死亡率:各組EAE大鼠發(fā)病癥狀及死亡率以EAE對照組最高，MAT-H組最低;與EAE對照組相比，各MAT組發(fā)病癥狀及死亡率降低(P＜0.01、P＜0.05)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠發(fā)病癥狀及死

8、亡率依次降低，各MAT組間比較具有統計學差異（P＜0.05）。
　　2.中樞神經系統(CNS)病理變化:
　　(1)腦組織病理變化:各組EAE大鼠腦組織均可見數量不等的炎性細胞，對腦組織及血管的浸潤程度不同，以EAE對照組最為明顯，MAT-H組最輕，正常對照組未見異常。EAE對照組腦組織病理切片改變典型，表現為散在白質炎性脫髓鞘及少突膠質細胞破壞，嚴重可見軸索結構破壞，呈空泡樣缺失。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大

9、鼠腦組織炎癥病理改變程度依次減輕。
　　(2)腦組織炎癥病理評分:各組EAE大鼠病理評分以EAE對照組最高，為2.9±0.32分;MAT-H組最低，為1.2±0.63分。與EAE對照組相比，各MAT組病理評分降低明顯(P＜0.01、P＜0.05);MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠腦組織炎癥病理評分依次降低，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.01、P＜0.05)。
　　3.大鼠腦組織勻漿中細胞因子含量變化:與

10、正常對照組腦組織勻漿中IFN-γ、IL-17濃度及IFN-γ/IL-4值相比，EAE對照組、各MAT組其值顯著上升(P＜0.01);與EAE對照組相比，各MAT組腦組織勻漿中IFN-γ、IL-17濃度及IFN-γ/IL-4值水平明顯下降(P＜0.01)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ、IL-17濃度及IFN-γ/IL-4值依次下降，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.01、P＜0.05)。與正常對

11、照組腦組織勻漿中IL-4濃度相比，EAE對照組、各MAT組其濃度水平下降明顯(P＜0.01);與EAE組相比，各MAT組腦組織勻漿中IL-4濃度水平明顯上升(P＜0.01)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠腦組織勻漿中IL-4濃度依次升高，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.01)。
　　4.大鼠靜脈血中MBP濃度:與正常對照組靜脈血中MBP濃度相比，EAE對照組、各MAT組其濃度水平顯著上升(P＜0.01);與E

12、AE對照組相比，各MAT組靜脈血中MBP濃度水平明顯下降(P＜0.01)。MAT-L組、MAT-M組、MAT-H組大鼠靜脈血中MBP濃度依次下降，各MAT組間比較具有統計學差異(P＜0.01、P＜0.05)。
　　5.T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+)比例變化:與正常對照組大鼠相比，EAE對照組、各MAT組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細胞比例降低（P＜0.01、P＜0.05），CD4+/CD8+值升高(P＜0.05)。與EAE

13、對照組相比，各MAT組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細胞比例升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值降低(P＜0.01)。與MAT-L組相比，MAT-M組、MAT-H組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細胞比例升高(P＜0.01、P＜0.05)，CD4+/CD8+值降低(P＜0.01、P＜0.05)。與MAT-M組相比，MAT-H組靜脈血中CD4+、CD8+淋巴細胞比例升高(P＜0.01、P＜0.05)，CD4+/CD8+值降低(P＜0.

14、05)。
　　6.大鼠發(fā)病高峰期免疫生化指標與臨床及病理相關性分析:
　　(1)EAE對照組及各MAT組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ水平與發(fā)病潛伏期呈負相關，具有統計學差異(P＜0.01);與疾病進展期、高峰期神經系統功能受損、腦組織炎癥病理改變呈正相關，具有統計學差異（P＜0.01）。
　　(2) EAE對照組及各MAT組大鼠腦組織勻漿中IL-4水平與發(fā)病潛伏期呈正相關，具有統計學差異(P＜0.01、P＜0.05);與

15、疾病進展期、高峰期神經系統功能受損、腦組織炎癥病理改變呈負相關，具有統計學差異(P＜0.01、P＜0.05)。
　　(3) EAE對照組及各MAT組大鼠腦組織勻漿中IL-17水平與發(fā)病潛伏期呈負相關，具有統計學差異(P＜0.01、P＜0.05)，與疾病進展期、高峰期神經系統功能受損、腦組織炎癥病理改變呈正相關，具有統計學差異（P＜0.01、P＜0.05）。
　　結論:
　　1.EAE大鼠發(fā)病高峰期機體免疫失去平衡，CD

16、4+、CD8+淋巴細胞比例下降，兩者比值上升;促炎癥因子IFN-γ、IL-17分泌增加，抗炎癥因子IL-4分泌減少;MBP濃度升高。
　　2.MAT具有減輕EAE大鼠的發(fā)病癥狀程度，使發(fā)病潛伏期延長、疾病進展期縮短，降低發(fā)病高峰期神經系統功能受損，減輕腦組織炎癥細胞的病理損害作用，其影響程度與MAT劑量大小呈正相關。
　　3.MAT防治EAE大鼠機制可能與使CD4+、CD8+淋巴細胞比例上升，兩者比值下降;降低促炎癥因子IF