懸浮培養(yǎng)293細胞生產腺病毒的工藝及BB102抗癌劑治療小鼠Lewis肺癌的實驗研究.pdf

1、第一部分:在最近的十幾年中，腺病毒已經成為了基因治療的有效載體。到目前為止，世界各國已經批準的基因治療臨床方案達到1000多個，腺病毒載體約占26％。由于越來越多的腺病毒基因藥物進入臨床前和臨床實驗，急需建立一種有效的可以放大的腺病毒生產工藝，生成出足量的符合臨床使用標準的腺病毒基因藥物產品。持續(xù)灌注懸浮培養(yǎng)293細胞是目前生產腺病毒最常用的方法之一，這種方法特別適合于工業(yè)化生產。對灌注培養(yǎng)293細胞生產攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的腺病

2、毒載體進行了實驗研究，結果表明，灌注率為1.5-2vol/d比較適宜；感染Ad-GFP后48小時是收獲細胞的最佳時機，此時的單細胞病毒含量在18200±1700VP/cell左右；細胞密度在3.0×106/ml左右感染病毒時單細胞病毒和單位體積病毒產量均較高。通過上述實驗我們初步建立起了利用5L生物反應器懸浮培養(yǎng)293N3S細胞生產Ad-GFP的生產工藝，可以獲得較大量高滴度的Ad-GFP。 第二部分:重組腺病毒純化的傳統(tǒng)方法是

3、氯化銫密度梯度超速離心，此方法產量小，更重要的是這種方法不能有效放大，不適合工業(yè)化生產。近年來應用陰離子交換樹脂已經逐漸成為了主要分離純化手段并取得了比較好的結果。我們應用兩步陰離子色譜法進行了重組腺病毒Ad-GFP的分離與純化，首先用QSepharoseXL對含有腺病毒的細胞裂解液進行第一次分離純化，然后將含有Ad-GFP的流出液用Source15Q進行第二次分離純化。實驗結果顯示，經QSepharoseXL第一次分離純化可以有效地去

4、除細胞裂解液中的部分雜蛋白，但不能獲得較純重組腺病毒Ad-GFP，再次經Source15Q純化后可以獲得理想的重組腺病毒，最終的腺病毒回收率在50％左右，產品經高壓液相及丙烯酰胺凝膠電泳分析得到了證實，與氯化銫密度梯度離心法獲得的腺病毒相似。此方法省時省力，可以進行靈活放大，適合于規(guī)?；a。 第三部分:P53基因的突變幾乎見于所有的人類腫瘤中，是腫瘤發(fā)病的重要機制之一。在肺癌中p53基因突變高達75％以上，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切

5、相關。突變的p53基因不僅促進細胞的生長和增殖，而且影響基因組的穩(wěn)定性從而加速細胞的惡變。野生型p53是最常見的抑癌基因之一，它通過多種途徑發(fā)揮抑癌作用，因此，野生型p53基因已成為目前腫瘤基因治療中的主要目的基因之一。GM-CSF是在抗原提呈細胞的成熟和功能發(fā)揮中起重要作用的一種細胞因子，將外源性GM-CSF導入腫瘤細胞，使其在腫瘤部位持續(xù)表達，形成一個GM-CSF高濃度的局部微環(huán)境，可促進抗原提呈細胞的成熟并提高其對腫瘤抗原的提呈和

6、加工處理能力。B7.1是一種免疫共刺激分子，它屬于免疫球蛋白超家族成員，與第二信號一起激活T細胞參與機體的細胞免疫。在缺乏共刺激信號的腫瘤細胞中導入共刺激分子基因使之有效表達，可誘導體內的T細胞產生強大的抗腫瘤免疫反應。BB-102抗癌劑系我實驗室構建的攜帶人野生型p53基因和腫瘤免疫相關基因GM-CSF、B7-1的重組腺病毒，我們應用BB-102抗癌劑對C57小鼠的Lewis肺癌的治療作用進行了實驗研究，實驗結果表明中劑量的BB-10