成骨細胞礦化過程中microRNA表達譜分析及miR-93的功能研究.pdf

1、第一部分小鼠成骨細胞礦化過程中microRNA表達譜的分析
　　 目的:
　　 誘導小鼠成骨細胞礦化，研究小鼠成骨細胞礦化過程中microRNA表達譜的變化。
　　 方法:
　　 體外手術分離培養(yǎng)新生小鼠顱骨原代成骨細胞，使用β-甘油磷酸(β-glycerophosphate，β-GP)和抗壞血酸(ascorbic acid)誘導成骨細胞礦化，茜素紅(Alizarin Red S)染色實驗觀察成骨細胞的礦

2、化情況。建立了誘導小鼠原代顱骨成骨細胞礦化的細胞模型。應用miRNA微陣列技術，分析小鼠成骨細胞礦化過程中miRNA表達譜的變化。通過qRT-PCR方法驗證表達明顯變化的miRNA在小鼠成骨細胞礦化過程中的表達情況。選取表達顯著降低的miR-93作為進一步的研究對象。
　　 結果:
　　 (1)采用體外手術分離法成功從小鼠顱骨分離出原代成骨細胞。
　　 (2)β-GP和抗壞血酸誘導小鼠成骨細胞培養(yǎng)至7天后，可見茜

3、素紅染色陽性的礦化結節(jié)形成。
　　 (3)用miRNA microarray芯片檢測小鼠成骨細胞礦化化過程中miRNA表達譜變化，發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA中表達明顯上調的有3個，分別是:mmu-miR-98，mmu-miR-130a，mmu-miR-210;表達明顯下調的有6個，分別是:mmu-miR-93，mmu-miR-103，mmu-miR-92b，mmu-miR-674，mmu-miR-351，mmu-miR-24。以m

4、mu-miR-93表達下調最為明顯。
　　 (4)對差異表達最明顯的miRNA進一步行實時定量RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)定量PCR結果與芯片結果一致，表明miRNA芯片結果是可靠的。
　　 結論:
　　 建立了誘導小鼠原代顱骨成骨細胞礦化的細胞模型。應用microRNA芯片發(fā)現(xiàn)小鼠成骨細胞礦化過程中，mmu-miR-98，mmu-miR-130a，mmu-miR-210表達明顯上調，而mmu-miR-93，mmu-m

5、iR-103, mmu-miR-92b, mmu-miR-674, mmu-miR-351, mmu-miR-24表達明顯下調。以mmu-miR-93表達下調最為顯著。
　　 第二部分miR-93對成骨細胞礦化的功能研究
　　 目的:
　　 研究miR-93在小鼠成骨細胞礦化過程中的作用。
　　 方法:
　　 用β-GP和抗壞血酸誘導小鼠成骨細胞礦化，Northern印跡雜交檢測miR-93在此過

6、程中的表達模式。根據(jù)miR-93前體序列設計引物，用PAJ-U6-CMV-eGFP vector合成miR-93慢病毒穩(wěn)定表達載體pre-miR-93。將pre-miR-93轉染小鼠成骨細胞，構建pre-miR-93過表達細胞模型，加入β-GP和抗壞血酸誘導分化，Northern雜交檢測miR-93表達變化，茜素紅染色觀察成骨細胞礦化水平。
　　 結果:
　　 (1)抗壞血酸和β-GP誘導小鼠成骨細胞礦化過程中，隨著誘導

7、時間延長，miR-93表達逐漸降低。
　　 (2)用PAJ-U6-CMV-eGFP vector成功構建miR-93慢病毒穩(wěn)定表達載體pre-miR-93，能在細胞中高表達miR-93。
　　 (3) miR-93過表達能抑制成骨細胞礦化形成，降低礦化結節(jié)茜素紅定量。
　　 結論:
　　 構建了miR-93表達載體，過表達miR-93可以抑制小鼠成骨細胞礦化。
　　 第三部分miR-93調控成骨細

8、胞礦化的機制研究
　　 目的:
　　 預測并驗證miR-93與其作用的靶基因間的相互作用，闡明miR-93/Sp7調控環(huán)路在小鼠成骨細胞礦化的作用機制。
　　 方法:
　　 用TargetScan和rna22等靶基因預測軟件分析得到小鼠原miR-93的靶基因。將含有miR-93結合位點的靶基因Sp7(trans-actingtranscription factor7，Osterix) CDS片段克隆到pG

9、L3載體，構建野生型報告載體WT-pGL3-Sp7-CDS。用QuickChange site-directedmutagenesis試劑盒構建了含有突變靶位點的突變型報告載體MUT-pGL3-Sp7-CDS。將這兩個載體分別與pre-miR-93或對照(miR-C)共同轉染小鼠成骨細胞，檢測熒光素酶活性變化以證實該靶基因是否為miR-93作用的靶基因。小鼠成骨細胞單獨轉染pre-miR-93，Western印跡雜交和實時定量PCR分別

10、檢測靶基因Sp7蛋白和mRNA水平的變化，明確miR-93對靶基因Sp7的調控作用。PCR擴增Sp7的CDS區(qū)全長，連接到pAJ慢病毒表達載體構建野生型Sp7-CDS表達載體，同時用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒構建了含突變靶點的突變型Sp7-CDS表達載體。將這兩個表達載體分別與pre-miR-93或miR-C共同轉染小鼠顱骨成骨細胞，穩(wěn)定轉染后茜素紅染色觀察成骨細胞礦化小結的形成，靶

11、基因蛋白表達用Western印跡雜交檢測，進一步證實Sp7為miR-93在成骨細胞礦化過程中重要的靶基因。通過公布的小鼠轉錄起始位點(TSS)預測文庫，根據(jù)第四位賴氨酸三甲基化的H3組蛋白(H3K4me3)在TSS位點周圍的富集與啟動子CpG島為主要標識，預測miR-93的TSS。運用TF-seach轉錄因子結合位點預測軟件分析miR-93的TSS上游2kb內的DNA序列，預測miR-93啟動子區(qū)可能結合的轉錄因子。通過凝膠遷移滯后實驗

12、(EMSA)、染色質免疫沉淀法(ChIP)，驗證Sp7與所預測結合位點的相互關系。采用轉錄因子熒光素酶報告基因活性進一步驗證Sp7與miR-93的TSS上游2kb內的DNA序列的結合及對miR-93的轉錄抑制作用。通過PCR擴增Sp7 cDNA并亞克隆至pAJ載體，構建Sp7表達載體pAJ-Sp7，慢病毒穩(wěn)定轉染成骨細胞，并構建特異性阻斷Sp7蛋白表達的慢病毒短發(fā)卡RNA(shRNA)-Sp7表達載體，轉染成骨細胞，建立穩(wěn)定轉染，分別采

13、用Northern blot和qRT-PCR檢測miR-93的表達，研究Sp7對miR-93表達的調控作用。
　　 結果:
　　 (1) TargetScan和rna22等靶基因預測軟件預測Sp7為miR-93作用的靶基因。
　　 (2)與轉染miR-C對照組相比，pre-miR-93和WT-pGL3-Sp7-CDS共轉染組的熒光素酶活性受到明顯的抑制，而pre-miR-93和MUT-pGL3-Sp7-CDS共轉

14、染組的熒光素酶活性則無明顯變化。
　　 (3)單獨轉染pre-miR-93可以降低Sp7蛋白水平，而對Sp7mRNA水平無影響。
　　 (4) pre-miR-93與WT-pAJ-Sp7共同轉染能減少成骨細胞礦化，降低Sp7蛋白表達水平;而pre-miR-93與MUT-pAJ-Sp7共同轉染不能降低成骨細胞礦化水平，對Sp7蛋白水平?jīng)]有影響，突變型Sp7 CDS全長可以消除miR-93所致的對成骨細胞礦化的抑制作用及其對

15、Sp7蛋白表達的抑制作用。
　　 (5) TF search轉錄因子預測軟件預測Sp7在miR-93的TSS上游2kb內的DNA序列的結合。
　　 (6)凝膠遷移滯后實驗(EMSA)示Sp7蛋白與靶結合位點的結合，特異性Sp7抗體驗證了Sp7的存在，靶結合位點的突變則無蛋白質與結合結合位點的結合。
　　 (7) ChIP實驗證實Sp7結合于所預測的轉錄因子結合位點。
　　 (8)與轉染control對照組

16、相比，Sp7和WT-pGL3-promoter共轉染組的熒光素酶活性受到明顯的抑制，而Sp7和MUT-pGL3-miR-93-promoter共轉染組的熒光素酶活性則無明顯變化。因此，我們認為miR-93主要通過抑制Sp7蛋白表達來抑制成骨細胞礦化，而Sp7可以通過抑制miR-93的轉錄來促進成骨細胞的礦化。
　　 (9)單獨轉染Sp7可以降低miR-93的表達水平，而單獨轉染sh-Sp7可以提高miR-93的表達水平。

17、　　 結論:
　　 (1)構建了野生型和突變型Sp7 CDS熒光素酶報告基因載體、miR-93表達載體、野生型和突變型miR-93啟動子區(qū)靶結合序列熒光素酶報告基因載體以及野生型和突變型Sp7 CDS全長慢病毒表達載體。
　　 (2)通過靶基因預測軟件預測并經(jīng)熒光素酶報告基因檢測證實Sp7為miR-93作用的靶基因，且通過靶基因預測軟件預測并經(jīng)凝膠遷移滯后實驗、染色質免疫沉淀實驗、啟動子熒光素酶報告基因檢測證實Sp7為