miRNA-125b-1對(duì)乳腺癌SKBR-3細(xì)胞放化療敏感性的影響.pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌(breastcancer)是指發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是女性常見(jiàn)的腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的7％-10％。全世界每年新發(fā)乳腺癌約150萬(wàn)例，死亡約57萬(wàn)例。北美、歐洲等西方發(fā)達(dá)國(guó)家為高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率為亞、非、拉地區(qū)的4倍左右。我國(guó)雖屬乳腺癌低發(fā)區(qū)的國(guó)家，但近20年來(lái)發(fā)病率有增高趨勢(shì)，特別是在北京、上海、廣州等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，乳腺癌已成為威脅女性健康的重要危害，有可能超過(guò)宮頸癌而居女性惡性腫瘤的

2、首位。乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，發(fā)生機(jī)制涉及多基因的突變，包括癌基因激活、抑癌基因失活以及其它相關(guān)調(diào)節(jié)基因的突變，從而使細(xì)胞基因組失去穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。又由于女性乳房淋巴管網(wǎng)，回流靜脈之間吻合豐富，乳腺癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移至肺、骨肝、腦等，致使治療變得更加困難，死亡率大大增加。乳腺癌治療主要以傳統(tǒng)的手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以局部或全身的放射治療、化療及內(nèi)分泌治療。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)研究的迅速進(jìn)展，以及腫瘤發(fā)

3、生基因?qū)W說(shuō)研究的突飛猛進(jìn)，給乳腺癌的早期診斷帶來(lái)新的希望。乳腺癌在基因治療方面的研究包括抑制原癌基因的功能、恢復(fù)抑癌基因的功能、基因免疫治療、自殺基因治療、多藥耐藥基因治療、抗腫瘤血管形成基因治療、凋亡基因治療、使用溶瘤病毒等。
　　 在對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)的研究中取得的令人振奮的發(fā)現(xiàn)之一就是鑒定出一類(lèi)調(diào)控發(fā)育的微小RNA(microRNA，miRNA)。在1993年，miRNA首次在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在已知miR

4、(N)A廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，是最大的基因家族之一，大約占到整個(gè)基因組的1％，每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)上百個(gè)基因的表達(dá)，而多個(gè)miRNAs可能以同一的方式同時(shí)作用于一個(gè)靶點(diǎn)來(lái)下調(diào)多種蛋白質(zhì)表達(dá)。在精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)及生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程方面發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約22nt的非編碼功能小R(N)A，它在許多生物中都有表達(dá)。miRNA原初轉(zhuǎn)錄本(Pri-miRNA)經(jīng)過(guò)核內(nèi)和胞質(zhì)中一系列的加工修飾后形成成熟的miRNA。首先，miR

5、NA基因在RNApolymerase(I)(I)作用下，轉(zhuǎn)錄生成pri-miRNA;然后在內(nèi)切酶Drosha作用下，pri-miRNA釋放出60-70nt的前體(Pre-miRNA)，后者具有不完美的發(fā)卡結(jié)構(gòu);最后，Pre-miR(N)A在exportin5作用下進(jìn)入胞質(zhì)，經(jīng)DICER切割形成成熟miRNA。成熟的miRNA通過(guò)與靶基因3'非翻譯區(qū)(3'UTR區(qū))形成不完全配對(duì)，從而抑制靶基因翻譯，或形成接近完全的配對(duì)，導(dǎo)致靶mRNA降

6、解。最近發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)基因組中，大約有533個(gè)miRNA基因座位，數(shù)目大約為蛋白編碼基因的1％，但可以調(diào)控大約1/3的人類(lèi)基因，說(shuō)明miRNA是一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA在很多生物的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，影響細(xì)胞發(fā)育、凋亡和增殖，并與疾病發(fā)生相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與miRNA的異常表達(dá)相關(guān)，例如乳腺癌、腦癌、慢性粒細(xì)胞白血病、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌等。所以一些miR(N)As可能在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物進(jìn)化過(guò)程

7、中起重要作用。Esquela-Kerscher，A等報(bào)道，使用miRNAs的基因治療可能是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效方法。如let-7已被證實(shí)可以抑制RAS癌基因，miR-15和miR-16可以抑制BCL2基因活性。人類(lèi)大多數(shù)miRNAs位于mRNA蛋白質(zhì)編碼或非編碼內(nèi)含子區(qū)。其他miRNAs可能遠(yuǎn)離染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)，在mRNA非編碼外顯子內(nèi)或者在mRNA3UTRs非編碼區(qū)，或與其他miRNAs聚集在一起(如在19號(hào)染色體上聚集有54個(gè)新發(fā)現(xiàn)的

8、miRNAs)。
　　 miRNA-125b-1就是miRNA其中一員，并且在大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)下降，推測(cè)其發(fā)揮抑癌作用。
　　 Scott，GK等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b-1可通過(guò)靶向作用于HER2和HER3mRNA和蛋白質(zhì)水平，抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Hofmann，MH等通過(guò)MDA-MA-435細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b-1可以靶向作用于c-raf-1mRNA3'UTR區(qū)，使得C-Raf蛋白以及下游靶

9、點(diǎn)細(xì)胞周期蛋白D1含量下降。Li，W等報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞系，miRNA-125b-1表達(dá)增加可以抑制ERK1/2的磷酸化，減低細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性。并且miRNA-125b-1的靶點(diǎn)有:ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-13(RAB13)、絲蘇氨酸蛋白激酶13(AURKC)、酪氨酸蛋白激酶受體Tie-1前體(TIE1)、磷酸肌酸3激酶調(diào)節(jié)亞基5(PIK3R5)等，這些結(jié)果顯示，miRNA-125b-1通過(guò)蛋白激酶途徑抑制細(xì)胞增生。在其他方面，Koma

10、gataS等，miRNA-125b-1前體在MCF-7細(xì)胞中可引起維生素D3羥化酶(CYP24)含量下降，推測(cè)癌組織中CYP24高表達(dá)與miRNA-125b-1含量下降相關(guān)。Smirnov，DA等研究顯示，ATM基因通過(guò)調(diào)節(jié)使轉(zhuǎn)錄因子CDX2含量增加，后者作用于miRNA-125b-1使其含量下降，而miRNA-125b-1以TNFSF4為作用靶點(diǎn)。ATM-CDX2-(miRNA-125b-1)-TNFSF4信號(hào)通路可能是乳腺癌等疾病患

11、病風(fēng)險(xiǎn)增加的調(diào)節(jié)機(jī)制。另外，Iorio，MV等，miRNA-125b-1的靶點(diǎn)有癌基因YES、ETS1、TEL、AKT3、生長(zhǎng)因子受體FGFR2、絲裂素活化信號(hào)轉(zhuǎn)移途徑分支:VTS58653，MAP3K10，MAPK14等。
　　 在前列腺癌，雄激素可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞miRNA-125b-1表達(dá)增加，后者可以抑制Bak1(凋亡誘導(dǎo)因子)基因的表達(dá)，最終刺激癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。miRNA-125b-1在前列腺癌的發(fā)生過(guò)程中起癌性作用。

12、而前列腺癌細(xì)胞中miRNA-125b-1含量的變化報(bào)道不一。
　　 在神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，miRNA-125b-1可以下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CDK6、CDC25A，起到抑制細(xì)胞增殖的作用，亦可以靶向作用于DGAT1和SGPL1，并對(duì)一些凋亡基因有負(fù)性調(diào)節(jié)，例如可以使BMF(細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2修復(fù)因子)含量下降進(jìn)而引起B(yǎng)c1-2表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，很多學(xué)者在探討miRNAs在阿爾茨海默病以及神經(jīng)元分化過(guò)程中的

13、作用，其中有miRNA-125b-1的參與。如Wu，L等在誘導(dǎo)鼠P19胚胎細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中，miR-125a和miRNA-125b-1通過(guò)lin-28癌基因的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)的兩個(gè)保守反應(yīng)區(qū)，可引起lin-28癌基因表達(dá)抑制。
　　 在血液系統(tǒng)，miRNA-125b-1在巨噬細(xì)胞分化成熟方面起重要作用，例如，Androulidaki，A等，LPS作用于巨噬細(xì)胞后，可以通過(guò)LPS-(PI3K/AKT)-miRNAs-TNF來(lái)起

14、作用，miRNA-125b-1也參與其中。由此，我們亦可以在乳腺癌細(xì)胞系中對(duì)此信號(hào)通路進(jìn)行研究。另外，在兒童急性髓細(xì)胞性白血病(AML)、小兒急性淋巴細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合癥(MDS)和急性髓性白血病等方面都有學(xué)者探討miRNAs在發(fā)病過(guò)程中所起的作用。
　　 在頭頸部鱗癌、未分化甲狀腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、泌尿道上皮癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥、牛皮癬、21三體綜合癥等方面都有miRNAs(包含miRNA-125b-1)

15、的研究。
　　 國(guó)內(nèi)在乳腺癌對(duì)于miRNA-125b-1研究很少。沈淑蓉等，使用RealtimeRT-PCR方法檢測(cè)42例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中miRNA-125b-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA-125b-1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)異常，可能和乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)。
　　 c-erbB-2原癌基因，又稱(chēng)HER-2/neu基因，定位于人染色體17q21，編碼一種具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的

16、物質(zhì)p185蛋白，即HER-2/neu蛋白。研究發(fā)現(xiàn)P185蛋白與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)有高度的同源性，它可能與未知配體結(jié)合后，通過(guò)增加蛋白激酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)化。c-erbB2/HER-2/neu基因的擴(kuò)增和p185erbB2蛋白的過(guò)度表達(dá)見(jiàn)于多種惡性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。在大多數(shù)乳腺癌患者體中，HER-2/neu呈高表達(dá)。因此，以HER-2/neu為靶標(biāo)進(jìn)行腫瘤治

17、療已受到廣泛關(guān)注。在HER-2/neu蛋白質(zhì)水平上，Genentech公司開(kāi)發(fā)出針對(duì)erbB2的抗體herceptin已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)在臨床應(yīng)用，對(duì)erbB2過(guò)表達(dá)的腫瘤具有很好的治療效果，herceptin單藥對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的有效率約15％，herceptin能誘導(dǎo)erbB2過(guò)表達(dá)的乳腺癌SKBR3細(xì)胞停止于G0/G1期，對(duì)SKBR3細(xì)胞增殖抑制率達(dá)63％。Herceptin被證實(shí)具有拮抗生長(zhǎng)信號(hào)系統(tǒng)、趨化免疫細(xì)胞以攻擊腫瘤細(xì)胞及

18、增強(qiáng)化療誘導(dǎo)的細(xì)胞毒等作用因此，erbB2受體己成為一個(gè)新的抗腫瘤靶點(diǎn)。在HER-2/neu基因水平，有人通過(guò)RNA干擾(RNAinterference，RNAi)基因阻斷技術(shù)，有人通過(guò)癌基因反義寡脫氧核苷酸技術(shù)，都能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的凋亡，細(xì)胞活力減低，使p185蛋白表達(dá)降低。但對(duì)miRNA-125b-1作用于HER-2/neu癌基因的研究非常少。傳統(tǒng)抗ErbB2單克隆抗體herceptin與ErbB2受體胞外結(jié)合域進(jìn)行特異

19、結(jié)合，抑制ErbB2同源二聚化，達(dá)到阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)的目的。但這種方法對(duì)于缺乏細(xì)胞外配體結(jié)合域的受體(P95ErbB2)以及ErbB2異源二聚體(ErbB2/ErbB3、ErB1/ErbB2、ErBI/ErbB3)無(wú)效。而miRNA-125b-1可與c-erbB-2癌基因mRNA3'UTR區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制ERBB2。
　　 本研究通過(guò)使用miRNA-125b-1作用于SKBR-3細(xì)胞(Her2陽(yáng)性)，來(lái)探討mi

20、RNA-125b-1對(duì)Her2基因表達(dá)及對(duì)細(xì)胞放化療敏感性的影響。全新的作用機(jī)制決定了miRNA-125b-1更能從mRNA水平阻斷ErbB2受體信號(hào)傳到通路，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。這為我們對(duì)ErbB2陽(yáng)性的乳腺癌的治療提供了新方法。本研究擬合成miRNA-125b-1，利用脂質(zhì)體將miRNA-125b-1導(dǎo)入乳腺癌SKBR-3細(xì)胞中，抑制或封閉ErbB2基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增值、分化和誘導(dǎo)其凋亡的目的。同時(shí)檢測(cè)miR

21、NA-125b-1是否能夠提高乳腺癌對(duì)放療的敏感性。另外，miRNA-125b-1具有增強(qiáng)化療效果的作用，應(yīng)用針對(duì)Her2的miRNA-125b-1，同時(shí)應(yīng)用紫杉醇等化療藥物，檢測(cè)是否能夠提高乳腺癌對(duì)紫杉醇等化療藥物的敏感性。這種腫瘤治療方法把小干擾RNA同放化療進(jìn)行了完美的結(jié)合，具有極大的臨床研究?jī)r(jià)值。對(duì)miRNA-125b-1應(yīng)用于Her2陽(yáng)性的乳腺腫瘤提供了理論基礎(chǔ)，也為應(yīng)用于其他實(shí)體腫瘤的治療提供重要的參考價(jià)值。
　　

22、目的:
　　 探討miRNA-125b-1對(duì)乳腺癌SKBR-3細(xì)胞放化療敏感性的影響，及其對(duì)靶基因HER-2蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　 合成miRNA-125b-1并通過(guò)lipofectamine(T)2000轉(zhuǎn)染SKBR-3細(xì)胞，分別用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)和WesternBlot法檢測(cè)HER-2m

23、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率;經(jīng)不同劑量X線(xiàn)照射后，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞存活率，用單擊多靶數(shù)學(xué)模型進(jìn)行曲線(xiàn)擬合作圖，求曲線(xiàn)參數(shù)(D0)、(D4)和(N)值，比較細(xì)胞放射敏感性的變化。MTT法觀(guān)察miR(N)A-125b-1-1對(duì)紫杉醇作用于SKBR-3細(xì)胞增殖的抑制情況。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

24、析。計(jì)量資料用(x)±s表示，使用ShapiroWilk法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，P＞0.05為滿(mǎn)足正態(tài)分布;使用Leven'test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P＞0.05為滿(mǎn)足方差齊性;在方差不齊時(shí)，選擇近似F檢驗(yàn)Welch法方差分析。對(duì)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果做秩和檢驗(yàn)后再調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)做兩兩比較;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Mauchly'stestofsepericity進(jìn)行球形檢驗(yàn)，球形檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量P＞0.05不拒絕球形假設(shè)，并采用重復(fù)測(cè)量方差分析;RT-PC

25、R和Westernblot定量結(jié)果采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 miRNA-125b-1轉(zhuǎn)染后的SKBR-3細(xì)胞中HER-2mRNA(F=447.779,P=0.000)和蛋白質(zhì)水平顯著下降(F=10.073，P=0.012);轉(zhuǎn)染后的SKBR-3細(xì)胞出現(xiàn)了G2M期阻滯;miRNA-125b-1組細(xì)胞增殖抑制率與陰性對(duì)照組相比，差異有顯著性(F=139.590，P=0.000)

26、;曲線(xiàn)擬合后顯示，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(D0=1.866，Dq=2.681，N=4.207)與對(duì)照組(D0=2.513，Dq=4.097，N=5.107)相比DO，Dq和N值均下降(SER=1.347)，提示細(xì)胞放射敏感性增加。用miRNA-125b-1處理組細(xì)胞的IC50與未處理組相比下降2.69倍(P＜0.05)，由此表明，miRNA-125b-1可增加乳腺癌SKBR-3細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。
　　 結(jié)論:
　　 miRNA