免疫球蛋白C在前列腺癌細胞的表達及RNA干擾IGHG1基因表達對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是威脅男性健康的常見腫瘤之一。在美國，PCa的發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第1位，死亡率是11％，僅次于肺癌，列在腫瘤性死亡的第2位[1]。2004年美國大約有230，110例新發(fā)PCa，有29，900例死于此病。在全球范圍，PCa的發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第3位[2]。在歐洲，每年得到確診的新發(fā)PCa病例大約有260萬人，PCa占全部男性癌癥人數(shù)的11％，占全部男

2、性癌癥死亡人數(shù)的9％[3]。近年隨著人口老齡化及生活條件的改善，我國前列腺癌發(fā)病率有明顯增加的趨勢，逐年增加，1997年發(fā)病率約2.0人/10萬男性人口，至2000年為4.55人/10萬男性人口，在男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率躍居第三位[4]。
　　 但是迄今為止，前列腺癌的發(fā)病機制并未研究明晰，且前列腺癌的臨床癥狀不典型，病情隱匿，臨床上大約有1/3的患者在診斷時已經(jīng)存在局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，已失去了手術(shù)治療的機會，而采用

3、以去勢治療為基礎(chǔ)的內(nèi)分泌治療，其療效常常不佳，該類患者的中位緩解時間18～20個月，對內(nèi)分泌治療失去療效，最終所有病人都將進展為雄激素非依賴性前列腺癌和（或）激素難治性前列腺癌[5-9]。目前，對于中、晚期前列腺癌的治療仍是個難題，如何有效地治療激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌依然是研究的難點。目前國內(nèi)外學(xué)者都在探求基因水平的調(diào)控方法和新靶點，因此，尋找有效的分子靶向治療手段一直是近幾年來前列腺癌治療的熱點[10，11]。

4、>　　 經(jīng)典的免疫學(xué)理論認為，免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是B淋巴細胞的特征性產(chǎn)物，其他的體細胞不會表達Ig。但近年來的多位學(xué)者研究證實上皮來源惡性腫瘤如:乳腺癌、惡性黑色素瘤、肺癌和消化道腫瘤等及軟組織肉瘤均有Ig樣物質(zhì)表達，其具有促進腫瘤細胞生長的作用，并進一步證實在這些惡性腫瘤細胞中存在Ig基因的轉(zhuǎn)錄[12，13]。Golda等觀察到前列腺癌患者體內(nèi)血清IgG的濃度通常升高[14]。另Babbage等研究發(fā)現(xiàn)

5、乳腺癌細胞分泌的IgG可激活誘導(dǎo)型二磷膽堿脫氨酶活性，具有進一步增強腫瘤細胞誘導(dǎo)發(fā)生異常突變的能力[15]。許多研究表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，Ig發(fā)揮著重要作用。Zheng等[16]不僅證明許多非造血性細胞表達Ig，且進一步證實在人類上皮來源的癌細胞中，免疫球蛋白的基因轉(zhuǎn)錄物有著VDJ重組特征。國內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)包括IgG在內(nèi)的癌細胞源性Ig能夠抑制效應(yīng)Ig分子介導(dǎo)的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用，對上皮性腫瘤細胞的增殖能力有一定的

6、促進作用。已經(jīng)證實Ig的高表達與腫瘤臨床分期、病理分級呈正相關(guān)，可作為評判肉瘤預(yù)后的指標(biāo)之一[13,17]。通過抗人IgG抗體或用反義寡脫氧核苷酸封閉腫瘤來源的IgG活性，具有明顯的抑制腫瘤細胞生長、降低IgG表達、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，并抑制人上皮來源的腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的生長，這使其可成為腫瘤的分子靶向治療提供潛在的靶點。
　　 前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展與人體內(nèi)雄激素密切相關(guān)，但其確切發(fā)病機制目前尚不清楚。有研究表明由上皮來源的腫瘤

7、患者體內(nèi)血清IgG、IgA或IgM抗體的濃度通常升高，這些腫瘤包括有乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌和前列腺癌。但是對于檢測Ig在前列腺癌中表達及功能研究，鮮見報道。國內(nèi)外尚缺少雄激素倚賴型前列腺癌細胞株表達Ig，以及癌細胞從雄激素依賴型向雄激素非依賴型轉(zhuǎn)化后表達Ig有無變化的相關(guān)研究。目前對癌細胞表達的Ig在腫瘤進展、轉(zhuǎn)化時所起的正性推動作用的判斷是否也適用于前列腺癌？阻止Ig表達或?qū)笽g能否促進前列腺癌細胞凋亡？由此設(shè)想，如能證

8、明在不同類型的前列腺癌細胞株可表達IgG，進一步研究針對IgG的分子靶向治療的效果，可能為前列腺癌癌變機制提供新的線索，也將為中、晚期前列腺癌的生物治療提供了一個新的靶點和研究方向。
　　 鑒于目前激素非依賴性前列腺癌和難治性前列腺癌對內(nèi)分泌治療、放療及化療等各種治療均不敏感，患者中位存活時間短，積極尋找有效的分子靶向治療手段成為當(dāng)下研究的重點。陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的前列腺特異性膜抗原(PSMA)、黏蛋白-1、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4

9、(CTLA-4)等腫瘤相關(guān)抗原，為前列腺癌的免疫治療提供了新的思路。根據(jù)藥物作用的細胞信號靶點，近年來PCa分子靶向治療主要著眼于:抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、蛋白激酶抑制、表皮生長因子受體(EGRF)信號通路靶向抑制、內(nèi)皮素信號通路拮抗等[18-22]。由于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一個復(fù)雜的、多因素交叉對話的蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，大多數(shù)實體腫瘤都是多靶點、多環(huán)節(jié)的調(diào)控過程。處于不同分化階段的腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，使得單一途徑的靶向治療往往

10、不足以遏制腫瘤進展?？紤]到傳統(tǒng)雄激素阻斷療法的單靶點性，今后腫瘤治療和藥物研發(fā)的方向?qū)D(zhuǎn)向多靶點聯(lián)合阻斷;致力于深入研究誘發(fā)激素難治性前列腺癌的最關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，找出最敏感且特異性最高的治療靶點;找出能預(yù)測前列腺癌預(yù)后和有激素難治性前列腺癌傾向的最敏感的指標(biāo)，并設(shè)計出合理的檢測方法，達到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的。
　　 RNA干擾(RNAinterfernce，RNAi)是近期發(fā)展起來的一種新的基因治療和診斷技術(shù)，RNA干擾是

11、指利用小RNA（包括小干擾RNA即siRNA）序列抑制特定基因信號的過程。將具有特定序列的siRNA導(dǎo)入腫瘤細胞內(nèi)，可引起同源序列mRNA的特異性降解，來高效特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達，使細胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，從而達到某些實驗或治療目的，并廣泛應(yīng)用于腫瘤的基因治療[23]，近年來，RNAi技術(shù)的發(fā)展為前列腺癌治療的研究提供了一種新思路，我們設(shè)想通過RNA干涉的方法，抑制IgG的表達，誘導(dǎo)非激素依賴性前列腺癌細胞的凋亡，以探討對非

12、激素依賴性前列腺癌細胞的基因治療。
　　 目的:
　　 (1)體外培養(yǎng)前列腺癌兩種不同類型細胞株LNCaP、PC-3表達IgG的強度和部位，揭示PCa細胞表達Ig的基本特點。
　　 (2)通過對良性前列腺增生組織和前列腺癌組織表達IgG強弱的觀察，探討IgG在前列腺癌組織中的表達意義及與前列腺癌病理分級的相關(guān)性，初步明確IgG在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的可能關(guān)系，并探索IgG能否作為判斷前列腺組織惡性度的指標(biāo)。

13、　　 (3)構(gòu)建并篩選出最有效的siRNA，RNA干擾PC3細胞IGHG1基因的表達，研究其對PC3細胞生物學(xué)行為如生長增殖、凋亡等的影響，為以IGHG1基因為靶點治療前列腺癌尋找有效的治療策略;并初步探討沉默后誘導(dǎo)PC3細胞調(diào)亡的機制。
　　 方法:
　　 (1)通過培養(yǎng)LNCaP和PC3兩種不同類型前列腺癌細胞株，采用流式細胞儀技術(shù)檢測LNCaP和PC3細胞的IgG表達情況，進一步采用實時熒光定量PCR和Weste

14、rnblot檢測LNCaP和PC3細胞IgG1mRNA和IgG蛋白的相對表達量。
　　 (2)收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科前列腺癌根治手術(shù)標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)采用Envision兩步染色法檢測前列腺癌和前列腺增生癥組織中IgG的表達。
　　 (3)根據(jù)siRNA的設(shè)計原則設(shè)計并化學(xué)合成siRNA序列，篩選抑制效率最高的siRNA，復(fù)蘇培養(yǎng)前列腺癌細胞株P(guān)C3至對數(shù)生長期，將抑制效率最高的IGHG1-siRNA轉(zhuǎn)

15、染入前列腺癌細胞株P(guān)C3中，觀察轉(zhuǎn)染效果，設(shè)轉(zhuǎn)染組、空白對照組、陰性對照組三組;并通過熒光定量PCR和westernblot實驗觀察其下調(diào)IGHG1在人前列腺癌PC3細胞中表達的效率，檢測轉(zhuǎn)染后3個組IgG1-mRNA和IgG蛋白的表達變化。
　　 (4)采用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后前列腺癌PC3細胞凋亡的情況;MTS法檢測轉(zhuǎn)染后各組人前列腺癌PC3細胞的生長情況;并通過熒光定量PCR和Westernblot的方法檢測下調(diào)IGHG1

16、表達后Caspase3蛋白的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)流式細胞儀檢測LNCaP和PC3細胞株的細胞膜表面及胞漿內(nèi)均有IgG的表達，LNCaP細胞胞膜及胞漿IgG陽性表達率為2.96％和89.22％;PC3細胞IgG陽性表達率為86.73％和90.99％。進一步通過熒光定量PCR和Westernblot檢測LNCaP和PC3細胞的IgG1-mRNA和IgG蛋白的相對表達量。LNCaP細胞IgG1-mRNA相對表

17、達量為1±0.37，PC3細胞IgG1-mRNA相對表達量為3.08±0.15，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，t=0.295，P=0.001。Westernblot檢測PC3和LNCaP細胞的IgG蛋白的相對表達量分別為1.92±0.15，1.05±0.86，兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，t=0.238，P=0.001。
　　 (2)免疫組化示前列腺癌細胞染色呈不均一性，陽性反應(yīng)主要位于胞漿。前列腺癌組織中IgG蛋白陽性表達率為91.

18、1％(41/45)，而對照前列腺增生組織中IgG蛋白的陽性表達為12.5％(5/40)。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=49.585，P=0.000)。前列腺癌組織中IgG蛋白表達強度與患者年齡、PSA無關(guān)，P＞0.05，與Gleason評分病理分級呈正相關(guān)，rs=0.403，P=0.006，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (3)轉(zhuǎn)染后，IGHG1-siRNA轉(zhuǎn)染組的IgG1mRNA相對表達量為1.28±0.43，陰性對照組與空白對照

19、組相的相對表達量分別為8.82±1.33、8.07±1.78;Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后各組IgG蛋白水平上的表達變化，空白對照組和陰性對照組相對表達量分別為2.85±0.24和3.01±0.16，而siRNA轉(zhuǎn)染組IgG蛋白相對表達量為1.24±0.11，轉(zhuǎn)染組的IgG1mRNA和蛋白的相對表達量均有明顯降低，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而陰性對照組和空白對照組兩組相比較沒有顯著變化（P＞0.05）。

20、>　　 (4)MTS法證實沉默IGHG1表達之后，在轉(zhuǎn)染后48對前列腺癌細胞的生長具有明顯的抑制效應(yīng)，抑制前列腺癌細胞增殖，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.001，轉(zhuǎn)染后對PC3細胞生長抑制作用隨時間變化呈線性趨勢，48和72小時的抑制率為31.3％、43.3％。各組PC3細胞轉(zhuǎn)染48h后，流式細胞術(shù)檢測示轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率為5.29％±0.41％，促進細胞調(diào)亡，空白對照組調(diào)亡率為1.49％±0.29％和陰性對照組的調(diào)亡

21、率為1.92％±0.17％，轉(zhuǎn)染組與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而陰性對照組和空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5)siRNA轉(zhuǎn)染48h后，利用熒光定量PCR檢測siRNA干擾組的caspase-3mRNA的相對表達量為3.93±0.28，陰性對照與空白對照組的相對表達量分別為2.51±0.43，2.47±0.36;經(jīng)單因素方差分析，實驗轉(zhuǎn)染干擾組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

22、(P=0.004)，而陰性對照組與空白對照組兩組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。通過westernblot檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞caspase-3蛋白的相對表達量，空白對照組和陰性對照組caspase-3蛋白相對表達量分別為0.92±0.12和1.06±0.14，兩組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而siRNA轉(zhuǎn)染組caspase-3蛋白相對表達量為1.34±0.11，顯著高于空白對照組及陰性對照組(P=0.014)。

23、　　 結(jié)論:
　　 (1)IgG在LNCaP和PC3細胞均有表達，PC3細胞中高表達，提示其與前列腺癌的惡性程度密切相關(guān)。
　　 (2)IgG在前列腺癌組織中高表達，與Gleason分級呈正相關(guān)，與前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可作為前列腺癌預(yù)后的評判指標(biāo)。
　　 (3)靶向IGHG1基因的RNAi可明顯抑制PC3中IgG基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。靶向沉默PC3細胞中IGHG1基因的表達后，可明顯