人源AGO2基因表達質粒構建及初步應用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、miRNA是目前發(fā)現的具有重要生物學功能的內源性非編碼RNA?，F已知miRNA是通過RNA沉默復合體(RISC)降解或抑制靶基因的翻譯，但其中的具體作用機制還不很清楚。Argonaute(AGO)蛋白是RISC中最重要的組份。AGO蛋白具有不同的亞族，人類細胞中包含亞族AGO2蛋白的RISC具有剪切靶基因的活性。本論文的主要工作是構建熒光蛋白AGO2的融合蛋白表達載體，獲得穩(wěn)定表達熒光蛋白標記AGO2的細胞體系，并由此研究miRNA發(fā)揮

2、功能的作用。
　　本論文取得了如下研究成果：
　　1、成功地構建了重組熒光Kaede-AGO2表達載體。以HeLa細胞系為研究模型，通過提取HeLa細胞總RNA并逆轉錄生成AGO2的cDNA；以cDNA為模板，通過PCR獲得含BamHⅠ及HindⅢ酶切位點的AGO2基因；采用TA克隆法及藍白斑篩選法獲得重組克隆載體pMD19T-AGO2；通過雙酶切技術及T4DNA聯(lián)接酶、抗藥篩選法獲得重組表達Kaede-AGO2載體。

3、>　　2、獲得了穩(wěn)定表達Kaede-AGO2的HeLa細胞系。通過陽離子轉染試劑將重組表達載體Kaede-AGO2導入HeLa細胞，優(yōu)化出轉染和篩選條件為：轉染濃度為DNA<3μg，DNA：轉染試劑=1:1；最佳篩選抗生素濃度為700μg/ml，維持生長抗生素濃度為350μg/ml；維持細胞穩(wěn)定生長最佳配比：回收培養(yǎng)液：新鮮培養(yǎng)液1:1。
　　3、通過融合蛋白Kaede-AGO2研究了外源miRNA作用過程：觀察了AGO2在細胞內

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