腸三葉因子受體的分離、鑒定及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、背景:腸三葉因子(intestinal trefoil factor,ITF或TFF3)是含有59個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽[1],分子量為6.7kD,分子中含有1個(gè)三葉結(jié)構(gòu),其核心的38～39個(gè)氨基酸殘基中包含6個(gè)半胱氨酸,形成3對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵,兩兩相接產(chǎn)生特征性三葉結(jié)構(gòu),并因此而得名。研究表明,ITF是具有潛在藥用價(jià)值的小分子多肽,能減輕各種致傷因素導(dǎo)致的粘膜損傷,促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖、移行,從而啟動(dòng)受損腸粘膜修復(fù),促進(jìn)粘膜屏障重建[2-4

2、]。但I(xiàn)TF作用機(jī)制迄今尚不清楚,雖然觀察到ITF與多條信號(hào)通路有關(guān),但都不能完整地描繪出其作用信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。一些學(xué)者推測(cè)ITF可能通過(guò)自身受體(ITFreceptor,ITFR.)來(lái)傳導(dǎo)信號(hào),介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和移行。本課題組前期進(jìn)行了ITF受體配體放射性結(jié)合分析、動(dòng)力學(xué)研究,明確:ITF受體與配體結(jié)合相關(guān)參數(shù)及受體密度等數(shù)據(jù),提出腸上皮細(xì)胞膜上存在特異ITF受體(ITFR)的觀點(diǎn)。但I(xiàn)TFR是已知還是未知蛋白,其理化性質(zhì)和功能均不清楚。

3、r>　　 目的:通過(guò)重組表達(dá)含有生物標(biāo)簽的hITF融合蛋白,利用pull-down技術(shù)釣取ITFR,并采用質(zhì)譜分析、生物信息學(xué)分析及酵母雙雜交等方法對(duì)獲取的蛋白進(jìn)行綜合分析,以確定該蛋白是否為ITFR。
　　 方法:
　　 1.制備用于受體研究的重組hITF融合蛋白
　　 (1)hITF在畢赤母酵母菌中的表達(dá)和純化:采用本課題組保存的酵母菌X-33(含pGAPZaA-hITF),組成性表達(dá)hITF,表達(dá)上清經(jīng)硫

4、酸銨分級(jí)沉淀,Ni+-NTA親和層析,超濾純化三步法進(jìn)行純化濃縮,純化后產(chǎn)物Western blot鑒定。
　　 (2)hITF融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化:通過(guò)PCR獲取ITF成熟肽cDNA基因片段,克隆至質(zhì)粒pGEX-4T-1獲得重組載體;雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)化至EcoliBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件獲得最大表達(dá)產(chǎn)量;GST瓊脂糖凝膠親和層析、超濾離心純化重組蛋白。SDS-PAGE蛋白電泳、Western bl

5、ot和質(zhì)譜鑒定ITF重組蛋白。
　　 2.ITFR的分離與生物信息學(xué)分析:以重組表達(dá)的帶有生物標(biāo)簽的hITF蛋白為誘餌,將其固化到親和層析凝膠上,與腸上皮細(xì)胞膜蛋白作用,利用受體配體間的相互作用,釣取受體蛋白,緩沖液沈脫,SDS-PAGE凝膠電泳分離,切膠酶解,質(zhì)譜分析捕獲的蛋白,并以免疫共沉淀予以驗(yàn)證。利用生物信息學(xué)軟件和文獻(xiàn)檢索軟件,分析所獲取蛋白的一般理化性質(zhì)、可能的跨膜區(qū)域、總疏水性、蛋白質(zhì)GO注釋,并以腸道、ITF及受

6、體為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,將所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。
　　 3.酵母雙雜交驗(yàn)證ITF相互作用蛋白:分別構(gòu)建誘餌質(zhì)粒和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29cDNA文庫(kù),提取質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)化至酵母菌Mav203;營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆,鑒定陽(yáng)性克隆后測(cè)序;應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì),分析是何種蛋白的基因序列。
　　 結(jié)果:
　　 1.hITF表達(dá)成功,獲得純度較高的重組hITF蛋白。
　　 (

7、1)hITF在酵母菌X-33中組成性表達(dá)成功,表達(dá)產(chǎn)量約為50mg/L,經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、Ni+-NTA親和層析、超濾離心后獲得純度95％以上的重組hITF蛋白。
　　 (2)獲得正確的hITF成熟肽cDNA序列,成功構(gòu)建含目的基因的重組載體pGEX-4T-1-hITF;在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要集中在細(xì)菌胞質(zhì)中。重組hITF融合蛋白產(chǎn)量約120mg/L。Western blot和質(zhì)譜分析

8、證明重組蛋白具有良好的抗原性和特異性且蛋白序列正確;通過(guò)GST瓊脂糖凝膠親和層析、超濾離心后重組蛋白的純度達(dá)95％以上。
　　 2.以含His標(biāo)簽的重組hITF融合蛋白為誘餌,利用pull-down技術(shù)獲得了一個(gè)分子量約為35kD的特異性條帶,以含有GST標(biāo)簽的重組hITF融合蛋白為誘餌蛋白的pull-down實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)該35kD蛋白的存在。對(duì)質(zhì)譜分析所獲得95個(gè)候選蛋白利用生物信息學(xué)手段分析蛋白的分子量、等電

9、點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、疏水性、蛋白分布、跨膜域預(yù)測(cè)和GO注釋,依據(jù)分子量大小、蛋白質(zhì)分布和可能的跨膜域GO注釋結(jié)果得到3個(gè)ITFR候選蛋白:PDZD2、Wnt8b、ITIH4,文獻(xiàn)檢索其與腸道、ITF及受體相關(guān)的文章分別為15篇、17篇、23篇。
　　 3.成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29cDNA文庫(kù),質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至酵母菌Mav203,篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定并測(cè)序,比對(duì)分析后共篩選出4個(gè)ITF相互作用蛋白:PDZD2、TIMP1、

10、CD44 antigen和VPS4-1。
　　 結(jié)論:
　　 1.制備了用于ITF受體研究的重組hITF融合蛋白。
　　 2.使用pull-down技術(shù)獲得了一個(gè)分子量約為35kD的特異性條帶并做質(zhì)譜分析,對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,初步判定PDZD2、Wnt8b、ITIH4為ITFR候選蛋白。
　　 3.酵母雙雜交獲取4個(gè)ITF相互作用蛋白.PDZD2、TIMP1、CD44 antigen和VPS4-