腫瘤微環(huán)境中趨化因子的表達(dá)和功能調(diào)節(jié).pdf

1、研究目的: 調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞來(lái)源的多種趨化因子的表達(dá)和功能。 第一章:研究用siMAML1阻斷黑色素瘤細(xì)胞中Notch信號(hào)傳遞途徑，誘導(dǎo)依賴(lài)于TweakR上調(diào)的CCL2的表達(dá)，引導(dǎo)更多免疫細(xì)胞動(dòng)員入侵腫瘤微環(huán)境。 第二章:探索血清溶血磷脂酸調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞/MoDC中CXCL16的生產(chǎn)和脫落的機(jī)理，了解LPA調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的趨化活性及其與Gi/o，Rho和NFkB通路的關(guān)系，探討通過(guò)調(diào)節(jié)CXCL16

2、以增加腫瘤局部免疫效應(yīng)細(xì)胞的可行性。 第三章:觀察來(lái)自單核細(xì)胞的不同分化階段的MoDC產(chǎn)生的趨化因子表達(dá)水平，探討調(diào)節(jié)CCL22和CCL17在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的機(jī)制與信號(hào)傳遞途徑，探索應(yīng)用DC腫瘤疫苗治療腫瘤時(shí)，特異性阻斷CCL22和CCL17的表達(dá)與功能，減少Treg的趨化移動(dòng)頻率，同時(shí)吸引更多的T效應(yīng)細(xì)胞到腫瘤部位去殺傷腫瘤細(xì)胞。 研究方法: 第一章、 SiMAML1通過(guò)上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞TweakR的表達(dá)誘導(dǎo)C

3、CL2的產(chǎn)生 1.用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)siMAML1，siHey1轉(zhuǎn)染對(duì)靶基因的抑制效果，及Tweak，TreakR和多種其他趨化因子基因的表達(dá)。 2.用Western-blot檢測(cè)以上分子相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。 3.用流式細(xì)胞術(shù)分析TweakR在細(xì)胞表面的表達(dá)。 4.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量CCL2在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)水平。 5.用單核細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞分泌趨化因子對(duì)單核細(xì)胞的趨化

4、功能。 第二章、 LPA提高LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CXCL16及調(diào)節(jié)細(xì)胞移動(dòng)功能的研究 1.用流式細(xì)胞術(shù)分析LPA受體及趨化因子CXCL16在巨噬細(xì)胞，MoDC和單核細(xì)胞表面的表達(dá)。 2.定性RT-PCR檢測(cè)LPA受體基因在巨噬細(xì)胞，MoDC和單核細(xì)胞中的表達(dá)。 3.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量CXCL16在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)水平。 4.用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)LPA/LPS對(duì)CXCL16基因表達(dá)的

5、調(diào)節(jié)作用。 5.用趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞，MoDC和單核細(xì)胞分泌趨化因子對(duì)T細(xì)胞的趨化功能。 第三章、在DC細(xì)胞分化和成熟過(guò)程中通過(guò)siRNA特異性抑制CCL22和CCL17的表達(dá)影響T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)員 1.用流式細(xì)胞術(shù)分析CD11c，CD11b，CD14在MoDC，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的表達(dá)，及趨化因子受體CCR1，CCR2，CCR4，CCR8，CXCR3，CXCR6在CD4/CD8 T細(xì)胞表面的表達(dá)。

6、 2.用趨化因子蛋白芯片分析MoDC，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中趨化因子的廣泛表達(dá)。 3.用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)CCL22，CCL17，CCL2基因在巨噬細(xì)胞，MoDC和單核細(xì)胞中的表達(dá)及siCCL22，siCCL17對(duì)其調(diào)節(jié)作用。 4.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量CCL22，CCL17，CCL2在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)水平。 5.用體外趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siCCL22/siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC對(duì)CD4/CD8 T

7、細(xì)胞及Treg的趨化功能。 6.建立人乳腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，體內(nèi)檢測(cè)siCCL22/siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC對(duì)CD4/CD8 T細(xì)胞的趨化功能。 研究結(jié)果： 第一章、 SiMAML1通過(guò)上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞TweakR的表達(dá)誘導(dǎo)CCL2的產(chǎn)生 1.SiMAML1增加TWeakR和CCL2的基因表達(dá)和蛋白生產(chǎn)SiMAML1成功轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞系M624后，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)顯示：與對(duì)照siRNA相

8、比，siMAML1幾乎完全抑制了MAML1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。 2.外源性Tweak刺激CCL2的生產(chǎn)外源性Tweak劑量和時(shí)間依賴(lài)性地刺激黑色素瘤細(xì)胞系M624和siMAML1轉(zhuǎn)染后的黑色素瘤細(xì)胞系M624 CCL2的生產(chǎn)，應(yīng)用anti-TweakR封閉抗體阻斷Tweak-TweakR，卻幾乎完全抑制了外源性Tweak對(duì)CCL2的誘導(dǎo)產(chǎn)生，證明Tweak刺激CCL2生產(chǎn)需要Tweak-TweakR的交連。 3.SiMAM

9、L1增加依賴(lài)于CCL2的單核細(xì)胞遷移趨化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究M624生產(chǎn)的CCL2的功能發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siMAML1轉(zhuǎn)染的M624細(xì)胞，其培養(yǎng)上清對(duì)單核細(xì)胞的趨化能力顯著增強(qiáng)。 第二章、 LPA提高LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CXCL16及調(diào)節(jié)細(xì)胞移動(dòng)功能的研究 1.巨噬細(xì)胞和MoDC細(xì)胞表面表達(dá)LPA受體流式細(xì)胞術(shù)分析顯示巨噬細(xì)胞和MoDC細(xì)胞表面表達(dá)LPA受體1和LPA受體2，但沒(méi)有LPA受體3。 2.巨噬細(xì)胞和MoDC細(xì)胞表

10、面表達(dá)CXCL16流式細(xì)胞術(shù)分析顯示巨噬細(xì)胞和MoDC細(xì)胞表面表達(dá)CXCL16，少數(shù)單核細(xì)胞表面表達(dá)CXCL16。 3.LPA增加巨噬細(xì)胞中CXCL16的生產(chǎn)和脫落用LPS刺激巨噬細(xì)胞以誘導(dǎo)趨化因子的釋放，ELISA法檢發(fā)現(xiàn)，LPA大大增加CXCL16在巨噬細(xì)胞的生產(chǎn)和釋放。 4.LPA刺激巨噬細(xì)胞CXCL16脫落的信號(hào)傳遞途徑作為特定的Gi/o受體蛋白，Rho及NFkB通路抑制劑，ELISA分析顯示PTx，exoC3，

11、PDTC均能顯著降低LPA刺激誘導(dǎo)的CXCL16蛋白的生產(chǎn)，這表明LPA刺激誘導(dǎo)的CXCL16蛋白的生產(chǎn)需要Gi/o，Rho，NFkB通路的活化。 5.LPA增加巨噬細(xì)胞的趨化活性趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)LPA/LPS刺激的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)CD3+T細(xì)胞的趨化能力顯著增強(qiáng)。 第三章、在MoDC細(xì)胞分化和成熟過(guò)程中通過(guò)siRNA特異性抑制CCL22和CCL17的表達(dá)影響T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)員 1.MoDC表達(dá)的趨化因子

12、與單核細(xì)胞不同由PBMC純化的CD14+細(xì)胞在培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞具有不同細(xì)胞的典型形態(tài)。 2.MoDC和單核細(xì)胞分泌的趨化因子對(duì)活化的T淋巴細(xì)胞的趨化能力不同MoDC的培養(yǎng)上清對(duì)CD4+和CD8+效應(yīng)淋巴細(xì)胞的趨化能力顯著高于單核細(xì)胞，但對(duì)靜止細(xì)胞的趨化能力相對(duì)較小。 3.抗體阻斷CCL22和CCL17能調(diào)節(jié)MoDC動(dòng)員CD4+/CD8+比率和Treg的頻率將MoDC與抗-CCL2，抗-CCL17，anti-C

13、CL22，anti-CCL23，或相應(yīng)非特異抗體對(duì)照作用后，趨化實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：阻斷CCL2對(duì)CD4+/CD8+ Treg的移動(dòng)頻率幾乎沒(méi)有影響，但是阻斷CCL17和CCL22顯著地降低CD4+/CD8+比率和Treg的移動(dòng)頻率。 4.用siRNA特異性的抑制CCL22和CCL17的表達(dá)可以調(diào)節(jié)CD4+/CD8+比率和MoDC動(dòng)員Treg的頻率應(yīng)用CCL17和CCL22特異性siRNA轉(zhuǎn)染后沉默了CCL17和CCL22基因和蛋白的

14、表達(dá)，體外趨化實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)果顯著地降低CD4+/CD8+比率和Treg的移動(dòng)頻率。 5.體內(nèi)瘤內(nèi)注射siCCL22和siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC招募更少Tregs但更多CD8+T細(xì)胞當(dāng)人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞株于裸鼠長(zhǎng)成實(shí)體瘤時(shí)，對(duì)照MoDC或經(jīng)siCCL22和siCCL17轉(zhuǎn)染的MoDC被注入腫瘤體內(nèi)后，實(shí)時(shí)定量熒光RT-PCR和ELISA法證實(shí)，在這些siRNA轉(zhuǎn)染的MoDC中，瘤體內(nèi)5-7天內(nèi)CCL22和CCL17幾乎被完全抑制

15、了，體外篩選的Tregs和激活CD8+T細(xì)胞混合液也被注入腫瘤體內(nèi)。 結(jié)論： 1. SiMAML1通過(guò)上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞TweakR的表達(dá)誘導(dǎo)CCL2的產(chǎn)生Notch信號(hào)傳遞途徑在黑色素細(xì)胞中的高表達(dá)和天然活化，導(dǎo)致其下游轉(zhuǎn)錄抑制因子Heyl的轉(zhuǎn)錄和激活，后者抑制TweakR在細(xì)胞表面的表達(dá)而抑制CCL2的表達(dá)和分泌，因此降低免疫細(xì)胞在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境的正常入侵和免疫監(jiān)視，表明Notch信號(hào)傳遞途徑代表腫瘤細(xì)胞擺脫自然免

16、疫監(jiān)視分子機(jī)制之一。siMAML1特異性阻斷Notch信號(hào)傳遞途徑下游的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，增加TweakR表達(dá)，擴(kuò)增了Tweak-TweakR之間的相互作用，誘導(dǎo)CCL2表達(dá)和自然免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此，針對(duì)Notch信號(hào)傳遞途徑的siMAML1應(yīng)作為一種探索治療腫瘤的免疫治療策略。 2.LPA提高LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CXCL16及調(diào)節(jié)細(xì)胞移動(dòng)功能的研究LPA顯著地增加巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生的CXCL16。經(jīng)LPA處理后，巨噬細(xì)胞/M

17、oDC分泌產(chǎn)生的可溶性CXCL16對(duì)活化T細(xì)胞也具化學(xué)吸附能力。LPA不僅能增加其他炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和脫落，也增加CXCL16的產(chǎn)生和脫落，進(jìn)而引導(dǎo)更多的活化T細(xì)胞到炎癥和腫瘤局部，發(fā)揮功能性免疫反應(yīng)。因而LPA上調(diào)巨噬細(xì)胞和MoDC表達(dá)CXCL16，最有可能趨化誘導(dǎo)炎癥和腫瘤部位的Th1和功能性細(xì)胞毒性效應(yīng)。LPA和趨化因子之間的有機(jī)聯(lián)系會(huì)促進(jìn)我們對(duì)脂質(zhì)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的認(rèn)識(shí)。 3.在DC細(xì)胞分化和成熟過(guò)程中通過(guò)siRNA特異